资源描述：
《pcr最新技术 原理及应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、PCR最新技术原理及应用。(polymerasechainreaction)一：PCR的基本成分。PCR包括7种成分：模板DNA,特异性引物，热稳定DNA聚合酶，脱氧核苷三磷酸（dNTP），二价阳离子，缓冲液及一价阳离子。（一）：模板DNA：待扩增的核酸序列。基因组DNA，质粒DNA，噬菌体DNA，预先扩增的DNA，cDNA和mRNA等几乎所有形式的DNA和RNA都能作为PCR反应的模板。（二）：特异性引物：与靶DNA的3’端和5’端特异性结合的寡核苷酸片段，是决定PCR特异性的关键。只有当每条引物都能特异性与模板DNA中的靶序列
2、复性形成稳定的结构，才能保证其特异性。引物越长，对于靶序列的特异性也越高。引物特异性及优化设计特性：碱基组成G+C含量应在40%~60%，4种碱基要分配均匀长度一般为18~25个核苷酸的长度，上下游引物长度差别不能大于3bp.重复及自身互补序列不能有大于3bp的反向重复序列或自身互补序列存在上下游引物的互补性一个引物的3’端序列不能结合到另一个引物的任何位点上。解链温度（Tm）locatedintheTomb,DongShenJiabang,deferthenextdayfocusedontheassassination.Linp
3、ing,Zhejiang,1ofwhichliquorwinemasters(WuzhensaidinformationisCarpenter),whogotAfewbayonets,duetomissedfatal,whennightcame两个引物的Tm值相差不能大于5摄氏度，扩增产物与引物的Tm值不能大于10摄氏度。3’末端尽可能使每个引物的3’末端碱基组成为G或C或，但不能为有NNCG或NNGC序列。（三）热稳定性DNA聚合酶：是PCR技术实现自动化的关键（四）脱氧核苷三磷酸：标准PCR反应体系中包括四种等摩尔浓度的脱氧核
4、苷三磷酸，dATP，dTTP，dGTP，dCTP。在常规PCR反应液中，每种dNTP的浓度一般是在200~500umol/L之间。高浓度的dNTP（>4mmol/L），对扩增反应有抑制作用。（五）二价阳离子：所有的热稳定DNA聚合酶都要求有游离的二价阳离子。常用的是Mg或Mn。由于dNTP和寡核苷酸都能结合Mg，因而反应体系中阳离子的浓度必须超过dNTP和引物来源的磷酸盐基团的摩尔浓度。（六）缓冲液：维持PCR反应体系的PH，必须用Tris-HCL缓冲液。标准PCR缓冲液中的浓度为10mmol/L，在室温将PCR缓冲液的PH调至8
5、.3~8.8之间。（七）一价阳离子：标准的PCR缓冲液溶液中包含有50mmol/L的KCL，它对于扩增大于500bp长度的DNA片段是有益的，提高KCL浓度到70~100mmol/L，对于改善扩增较短的DNA片段也是有益的。二：PCR的基本操作：locatedintheTomb,DongShenJiabang,deferthenextdayfocusedontheassassination.Linping,Zhejiang,1ofwhichliquorwinemasters(WuzhensaidinformationisCarpe
6、nter),whogotAfewbayonets,duetomissedfatal,whennightcamePCR是一种级联反复循环的DNA合成反应过程。一个循环过程有三个步骤；（1）变性，通过加热使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以清除；（2）退火，将温度下降至适宜的温度，使引物与模板DNA退火结合；（3）延伸，将温度升高，热稳定DNA聚合酶以dNTP为底物催化合成新生DNA链延伸。（一）变性：双链DNA模板的变性温度由其G+C的含量决定，模板DNA的G+C的含量越高，熔解温度也越高。变性的
7、时间由模板DNA分子的长短决定。在应用TaqDNA聚合酶进行PCR反应时，变性往往在94~95℃条件下进行。对于G+C的含量<=55%线性DNA模板，常规PCR的变性条件是94~95变性40s.当模板G+C的含量>55%时则需要更高的温度。locatedintheTomb,DongShenJiabang,deferthenextdayfocusedontheassassination.Linping,Zhejiang,1ofwhichliquorwinemasters(WuzhensaidinformationisCarpente
8、r),whogotAfewbayonets,duetomissedfatal,whennightcame一步PCR一步RT-PCR是指在同一管子中，利用同一种优化的反冲液，在反转录酶和热稳定DNA聚合酶等的存在下，直接以RNA或mRNA为起始材料进
