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1、TAILPCR一种DNA侧翼序列分离技术__________________________________________________在分子生物学研究中,基因克隆和分子杂交的探针制备等操作常需分离与已知DNA序列邻近的未知序列。热不对称交错PCR(thermalasymmetricinterlacedPCR,TAIL-PCR)是一种用来分离与已知序列邻近的未DNA序列的分子生物学技术。在分子生物学研究领域中,利用该技术分离出的DNA序列可以用于图位克隆、遗传图谱绘制的探针,也可以直接测序。该技术技术简单易行,反应高效灵敏,产物的特异性高,重复性好,能够在较短的
2、时间内获得目标片段,已经成为分子生物学研究中的一种实用技术。介绍__________________________________________________结构1，TAILPCR原理2，TAILPCR引物设计3，TAILPCR反应条件4，TAILPCR优缺点及其优化5，TAILPCR应用__________________________________________________TAILPCR以基因组DNA作为模板，利用依照目标序列旁的已知序列设计的3个较高退火温度的嵌套特异性引物(specialprimer,SP)，和一个较短且Tm值较低的随机简并(
3、arbitrarydegenerate,AD)引物组合，通过3轮具热不对称的温度循环的分级反应来进行PCR扩增，获得已知序列的侧翼序列。原理目的片段__________________________________________________第1次PCR反应由5次高特异性反应、1次低特异性反应、15次热不对称的大循环构成。通过5次高特异性的反应,使sp1与已知的序列退火并延伸,提高目标序列的浓度。1次低特异性的反应使简并引物结合到较多的目标序列上,随后进行15次TAIL循环。经过上述反应得到了不同浓度的3种类型的产物:特异性产物和非特异性产物(Ⅰ型和Ⅱ型)TA
4、IL-PCR一般分为3次反应__________________________________________________第2次反应将第一级反应的产物稀释1000倍作为模板,通过15次热不对称的大循环,使特异性的产物被选择性地扩增,而非特异性的产物被压制到极低的含量。__________________________________________________第3次反应又将第2次反应的产物稀释1000倍作为模板,通过15次热不对称的大循环。__________________________________________________通过上述3次PC
5、R反应可获得较高含量的与已知序列邻近的目标序列。Ⅱ、Ⅲ分别为TAIL2PCR反应中第2次和第3次反应的产物TAIL2PCR产物分析在多数情况下,第1次反应有较多的非特异性产物特异性引物在第1次反应中一般不能扩增到可被检测的水平,因此可以省去第1次反应产物电泳分析，仅仅检测第2次和第3次反应的产物来获得特异性的目标片段。取第2次反应产物和第3次反应产物成对点样。由于特异引物是嵌套的,因此特异性扩增的特点是第3次反应产物小于第2次反应产物。由于AD引物在特异性引物的下游有多个退火位点,同一目标序列有时会产生一个以上不同长度的特异性片段。_________________
6、_________________________________TAIL-PCR引物设计和一般的PCR反应相比，TAIL-PCR反应对引物的要求较高，引物的设计很是重要。特异性引物和简并引物的选择直接影响扩增的效果。特异引物设计3个嵌套的特异性引物长度一般在20~30bp之间，Tm值一般设为58~68℃。SP1、SP2和SP3之间最好相距100bp以上以便在电泳时更容易区分3轮PCR产物。简并引物设计简并引物是按照物种普遍存在的蛋白质的保守氨基酸序列设计的，相对较短，长度一般是14bp左右，Tm值介于30~48℃之间。AD引物是否最佳与它的简并度、引物长度和核苷酸
7、序列组成有很大关系。为了更好的与目标序列退火：首先，尽量选择简并度低的氨基酸区域作为引物设计区；其次，充分注意物种对于密码子的偏好性，选择该物种使用频率高的密码子，以降低引物的简并性；最后，尽量避免3‘末端的简并。__________________________________________________反应文件号循环次数温度设定第1次反应1194℃2min,95℃1min2594℃15s,63℃1min,72℃2min3194℃15s,30℃3min,以0.2℃/s升至72℃72℃2min41594℃5s,63℃1min,72℃2min94℃5s,63
