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时间:2019-06-26
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1、小白鼠染色体标本的制作、染色与观察姓名:学号:实验时间:2014.12.2~2014.12.91.实验目的(1)初步掌握小鼠睾丸细胞染色体标本的基本制作过程和Giemsa染色法,了解各操作步骤的原理。(2)了解常用实验动物染色体的数目及特点。(3)认识不同生物染色体的特征。2.实验原理凡处于活跃增殖状态或者经过各种处理,任何动物组织的细胞都可进入分裂时期,均可用于染色体分析。在正常动物体内,精巢和骨髓均为是活跃分裂的组织。给动物注射一定剂量的秋水仙素,即可使许多处于分裂的细胞停滞于中期,然后采用常规空气干燥法制备染色
2、体,即可得到大量可分析的染色体标本。本方法简便、可靠,不需要经体外培养和无菌操作,易于推广。骨髓细胞是用于动物细胞遗传学研究很好的材料。但在取材方面,精巢又比骨髓要简易一些,故本实验选用小鼠的精巢为实验材料。对于小鼠精巢染色体标本的制作,一般包括以下几个要点:①用一定剂量的秋水仙素破坏纺锤丝的形成,使细胞分裂停滞在中期,使中期染色体停留在赤道面处;②用低渗法使细胞膨胀,以至于在滴片时细胞胀破,使细胞的染色体铺展到载玻片上;③空气干燥法可使细胞的染色体在载片上展平,经Giemsa染色后便可观察到染色体的显微图象。Gie
3、msa染色是最常用的染色方法之一,适用于多种细胞和染色体染色。主要用Giemsa染液可以将细胞核染成紫红色或蓝紫色,胞浆染成粉红色,在光镜下呈现出清晰的细胞及染色体图像。3.实验材料和用品(1)材料:小白鼠(2)试剂:秋水仙素、生理盐水(0.9%的NaCl溶液)、0.3%KCl低渗溶液、固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)、Giemsa染液(3)器材:解剖盘、解剖镊、解剖剪、小烧杯(×2)、吸管、玻璃刻度离心管、恒温水浴锅、离心机、铜网、预冷载玻片、记号笔、普通光学显微镜、玻璃等4.实验步骤(1)小白鼠染色体标本制作①取雄
4、性小鼠以每克体重4μg注射秋水仙素,经14~16小时后,断头法杀死小鼠,取出睾丸用生理盐水(0.9%的NaCl)洗去血污。②放入装有1ml0.3%KCl液的小烧杯中剪碎至呈乳白色。③用铜网过滤到刻度离心管中,再加0.3%KCl液至4ml。④37℃静置30分钟,进行低渗处理。⑤以800~1000转/分离心8分钟。⑥弃上清液,加入2ml甲醇·冰醋酸固定液(3:1),并用吸管至管底吹气,轻轻打散细胞,固定8分钟。⑦再以800~1000转/分离心8分钟。⑧弃上清液,加1ml固定液,再制成细胞悬液,固定5分钟。⑨取洁净的低温预
5、冷载片,距载片10~15cm高度滴下2~3滴细胞悬液,从载片一边向另一边轻轻吹气,并同时轻轻敲打载片,以使细胞均匀分布和促使染色体展开。⑩用滤纸擦去载片上多余液体,空气干燥或成文火干燥。(2)小白鼠染色体标本染色与观察①倒置染色法——在玻璃板上用废旧载玻片作支架,使标本载玻片的标本面向下放置到支架上,在玻璃板和标本载玻片之间滴加Giemsa染液。目的一可以节省染料,二可以避免染液快速挥发,三可以防止染色颗粒沉淀,影响观察。在操作时应注意,多个样品同时染色应摆放紧密,不要有间隙;滴染液时应尽量慢,不要有气泡,以免部分染
6、色体不被着色。②用Giemsa染色20~30分钟,细水冲洗玻片背面,去多余染液,气干。③镜检:低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂相,高倍镜或油镜下观察染色体形态并计数。5.实验结果此图是经秋水仙素处理的小鼠精细胞染色体标本照片,数数发现有36条染色体而非40条,可能是应为染色体重叠程度太高而造成计量误差。视野中可见大量的精子,它们有一个比较圆的头部和鞭毛,还有一些细胞有一个尖,那是未变形的精子。部分细胞处于减数第一次分裂中期,这样的细胞是二倍体,应有40条染色体;有些处于减数第二次分裂中期,这样的细胞是单倍体,应有
7、20条染色体。还有一些细胞处于分裂期,但不是中期,这类细胞染色体的凝集程度不是很高,呈丝状。处于减数分裂中期的染色体染色质凝缩程度达到最大。小鼠的染色体多为端着丝粒染色体,呈“V”字形或“U”字形,染色体呈短棒状。6.讨论与结论(1)向小鼠腹腔注射秋水仙素时,用左手抓住小鼠背部的皮,右手持注射器,进针时倾斜45°,在开始注射前,将针头略向上挑,以免将秋水仙素注入小鼠的肠道内。注射过程中注意观察小鼠的反应。如果秋水仙素被正确注入腹腔内,小鼠应该是很安静的。(2)断头法处死小鼠后,血液要冲洗干净,以免影响实验观察。(3)
8、从开始加入0.3%KCl低渗溶液第一次离心前,时间最好控制在50-60min。过滤出来的如果不是乳白色悬浊液就再过滤一次。(4)两次离心的转速控制在800~1000转/分,不要太高,以免破碎细胞。第一次离心去上清液加固定液时时不要过分吹打,第二次离心后要充分将细胞吹开。(5)滴片时,使滴管与载玻片间的距离尽量远,这样细胞才能被“摔碎”,这一点十
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