《酶化学B》PPT课件

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1、第10章酶的作用机制和酶的调节一 酶的活性中心（一）、活性中心(activesite)的概念活性中心：活性中心：酶分子中直接与底物结合并催化底物发生化学反应的部位。活性中心分为结合部位和催化部位结合部位：负责与底物的结合，决定酶的专一性（与km有关）。催化部位：负责催化底物键的断裂形成新键，决定酶的催化能力效率（kcat)和催化性质。结合部位和催化部位也可以合二为一，活性部位可以提供调节部位，也可以为活性部位提供物质基础酶的活性中心（二）、活性中心的结构特点：1．活性部位在酶分子中只占一小部分（1％～2％）2．酶活性部位是一个三维的特定空间

2、结构3．酶的活性部位和底物有时不互补-诱导契合4.酶活性部位位于酶分子表面的一个裂缝内，裂缝内往往是个疏水的微环境。5．底物通过次级键结合到酶上，形成ES复合物。6．酶活性部位是柔性或可运动性，即酶与底物结合时构象发生一定的变化才互补。频率最高的活性中心的氨基酸残基：Ser、His、Cys、Tyr、Asp、Glu、Lys。酶与底物结合成ES复合物主要靠次级键：氢键、盐键、范德华力和疏水相互作用。----底物可以稳定酶！酶的活性中心（三）、研究活性中心的方法化学修饰法通常是比较在底物或竞争性抑制试剂是否存在的情况下的化学修饰1、酶分子侧链集团

3、的共价修饰（化学修饰）法酶的化学修饰法分类（1）、非特异性共价修饰某些酶活性中心含有的活性基团在活性中心以外不存在或很少，这时可选择某些非特异性试剂进行修饰（2）、特异性共价修饰如DFP（二异丙基氟磷酸）可与活性中心中的丝氨酸反应。如，DFP与胰凝乳蛋白酶作用（只和活性部位的丝氨酸残基的羟基结合）（3）.亲和标记法亲和标记（Affinitylabeling）：也属于共价修饰，主要是利用酶与底物特异性结合的原理而发展起来的一种特异性化学修饰法。（TPCK）修饰a－胰凝乳蛋白酶His57何谓亲和层析？Ks型不可逆抑制剂又称(?)研究活性中心的方

4、法(续)2、动力学参数测定法活性部位氨基酸残基(解离状态)和(酶活性)直接相关通过动力学方法求有关参数，对酶活性部位化学性质作出判断。通过研究酶活性与pH关系，可以推测到与催化直接相关的某些基团的pK值，进而推测这些基团的作用研究活性中心的方法(动力学分析法)核糖核酸酶最适PH=7.8参照最适PH值：谷氨酸、组氨酸或赖氨酸哪一个可能在活性中心？胃蛋白酶的最适PH值为2，哪一类氨基酸可能在活性中心？研究活性中心的方法(动力学分析法)酶最适pH活性中心的氨基酸胃蛋白酶1.8Asp215和Asp32胰蛋白酶7.7His57,Asp102,Ser1

5、95核糖核酸酶7.8His12,His119,溶菌酶5.2Asp52,Glu35研究活性中心的方法(续)4、定点诱变通过改变基因来改变蛋白质的结构，制造新的蛋白质。3、X－射线衍射分析法通常是将酶与底物类似物或专一性抑制剂形成复合物，而后作X－射线衍射分析。例如：(溶菌酶活性中心）定点诱变天冬酰胺后Kcat小了5000倍结论：？苯丙氨酸后Kcat不变Km提高了6倍结论：？胰蛋白酶突变突变羧肽酶A为验证羧肽酶ATyr248在催化中的作用，对其基因进行定点突变－Tyr248（TAT）定点突变为Phe（TTT）；实验结论是，Tyr248参与了与底

6、物的结合，但不是催化所必须的，此结论必定来自如下数据：A.Kcat突变后降低B.Km变大C.Kcat/Km升高D.Kcat不变E.Kcat/Km降低上海交通大学2007生物化学定点诱变突变为苯丙氨酸后：Kcat不变，Km提高了6倍如何确定活性部位？（习题）例：碘乙酸可使核糖核酸酶的侧链His119和His12烷基化而抑制酶活性。其中His119的修饰对酶影响最大,但是研究中发现这两个His永远不能同时被碘乙酸修饰,而且,碘乙酸的类似物碘乙酰胺不能作为酶的修饰剂。此外在pH5.5时碘乙酸一般不作用His,但在核糖核酸酶中,pH=5.5时,碘

7、乙酸可作用His,由上述现象可对核酸酶的活性部位得出什么结论?答：这是一个说明通过侧链修饰如何确定活性中心的例题。（1）His119和His12可能都处于活性部位，His119可能性更大或者His119是催化过程中第一启动者，（2）His119和His12不在同一个环境（3）由于酶环境的影响，His以质子供体的形式存在。有可能在his119和His12之间形成质子供体与质子受体的关系（四）、酶的必需基团（自学）必需基团：酶分子中与催化作用直接相关、不可缺少的化学基团。（1）、活性中心内的必需基团：结合基团：与底物结合，形成酶－底物复合物的部

8、位；催化基团：影响底物中化学键的稳定性，与底物发生化学反应，将底物变成产物。（2）、活性中心外的必需基团（调控基团或维持酶活性）构成酶活性中心的基团：His的咪唑基、Ser的-O