肿瘤相关巨噬细胞诱导肝癌细胞下调表达E-cadherin与其作用机制

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3、基质之间粘附的跨膜糖蛋白，对于维持上皮细胞的结构和形态起到非常重要的作用。E．cadherin目前被普遍认为是一种抑癌因子，原因在于E．cadherin的表达下调或缺失能够引发EMT(EpithelialtoMesenchymalTransition)，即细胞由上皮类型向问质类型转化，EMT的发生使得。、、-～一一细胞排列疏松，运动能力变强，进而引发肿瘤细胞转移和侵袭。目前已经发现』：一E．cadheri罐在诸多肿瘤如胃癌i结肠癌中表达下调，特别在肝细胞肝癌中缺失程度较高，并且与预后等有较密切的关系，但是肝细胞肝癌中E．cadher

4、in表达缺失的机制尚不是非常明确。炎症，特别是慢性炎症在在癌变中发挥重要作用，其通过肿瘤微环境中的炎性细胞及介质促进肿瘤的发展。肿瘤相关巨噬细胞(TAM)是浸润到肿瘤中最主要也是最关键的一种炎症细胞。在肝细胞肝癌中，TAM参与了肝癌的发生，增殖等多个过程，并且有研究显示，TAM密度与肝癌预后不良有关。但是在肝细肺J肝痛中．TAM介导转移的潜存功台旨乃机制还不清楚．本课题通过对肝细胞肝癌病人组织切片中E。cadherin的表达和11AM的浸润的山东大学硕士学位论文分析，在体外用分别用两种肝癌细胞系与巨噬细胞共培养模拟体内微环境，证明肝

5、细胞肝癌中E．cadherin、相关基因的表达及细胞的迁移能力与TAM的浸润密切相关，并通过抑制肝癌细胞系内的NF—KB信号通路证明，巨噬细胞可能通过活化肝癌细胞内NF．KB通路来引起以上的变化。方法一通过免疫组织化学方法检测肝癌病人组织切片中E．cadherin与TAM的表达(1)肝细胞肝癌病例切片的选取本课题收集山东大学齐鲁医院病理科肝细胞肝癌病人的肿瘤组织石蜡贮存块，并得到连续切片。所有病人在手术前没有接受任何程度的放射或化疗治疗。病人的性别、年龄、肿瘤大小及病理分级等资料都是来自病人的病历记录。(2)通过免疫组织化学方法检测

6、连续组织切片中E．cadherin与CD68的表达采用免疫组织化学方法，在厚度为4毫米的肝癌病人连续组织切片中对E．cadherin和CD68的表达分别进行检测。E—cadherin一抗为鼠抗(1：100稀释)；CD68一抗为鼠抗(1：100稀释)，二抗均为连接有辣根过氧化物酶的兔抗鼠抗体。PH9．0的EDTA抗原高压热修复，3％过氧化氢内源性封闭。一抗在湿盒内孵育过夜，使用DAB试剂盒显色，并使用苏木素复染细胞核。E．cadherin和CD68分别通过不加一抗来设立阴性对照组。(3)连续切片中E．cadherin和TAM数目的相关

7、性分析利用显微镜拍照系统对封片后的连续组织切片拍照，每张切片选取5至6个视野，200倍放大，TIFF格式保存。使用Image—ProPlusversion6．0软件对E．cadherin和CD68的阳性表达进行平均光密度分析并对TAM进行计数。所得到的数据通过GraphPadPrism5软件对其相关性进行分析。二肝癌细胞系与THP．1来源的巨噬细胞共培养并检测E．cadherin及与EMT发生相关基因的表达变化(1)肝癌细胞系与THP．1来源的巨噬细胞共培养人肝癌细胞系BEL．7402和SMMC。7721及人单核细朐系THP。1始1

8、桑白中围科学院一上海细胞所，分别用1640、EMEM、DMEM加10％M牛血清配制的培养山东大学硕士学位论文基37。C、5％C02常规培养。以320nM终浓度的佛波酯(PMA)诱导THP一1细胞24小时，使其贴壁为巨噬细胞，用PBS洗