《课件动物细胞工程》PPT课件

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1、二、动物细胞融合与单克隆抗体细胞融合是正常的生命活动两个细胞正在融合受精作用人工条件下，如何促成动物体细胞的融合？（一）动物细胞融合细胞融合诱导剂：灭活的病毒、（其它物理化学手段同植物体细胞杂交）灭活的病毒有丝分裂应用：主要用于制备单克隆抗体灭活病毒诱导细胞融合的原理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏这些病原体的抗原结构。主要用于制备单克隆抗体获得杂种植

2、株主要用途物理、化学方法（同左）灭活的病毒物理（离心、振动、电刺激）化学（聚乙二醇）诱导方法细胞膜的流动性细胞融合的原理动物细胞融合植物体细胞杂交比较项目植物体细胞杂交与动物细胞融合的比较如果患者想知道自己是否得了乙型肝炎，一般是先检查血液里是否有病毒的蛋白质，也就是病毒的抗原等21ABC血清中的抗体有时患者体内无乙肝病毒，但是用血清抗体进行检验时，会出现相应的免疫反应（即假阳性）。如何得到单一的抗体A或B？人们获得抗体的传统方法是什么？细胞融合、细胞重组、杂交瘤技术细胞融合将两个或多个细胞结合形成一个细胞（杂交细胞）。

3、细胞重组把不同细胞的部件重新组装，包括核移植、叶绿体移植、核糖体重建及线粒体装配等。杂交瘤技术通过细胞融合产生特异杂交瘤细胞，用于生产单克隆抗体。单克隆抗体制备的原理及流程（二）单克隆抗体1）注射特定抗原4）筛选杂交瘤细胞3）杂交瘤细胞特点1制备过程：5）细胞培养（克隆）6）提取单克隆抗体2单克隆抗体的优点：特异性强、灵敏度高①②③④⑤2）效应B细胞+骨髓瘤细胞→杂交瘤细胞⑥1）作为体外诊断试剂3应用结合药物的单克隆抗体2）运载药物如制备生物导弹鼠源性的嵌合的用于治疗是很受限制的。原因是：人源性的对鼠源化抗体进行改造--

4、-----蛋白质工程直接生产人源化抗体-------基因工程MonoclonalAntibodiesKöhler和Milstein75年建立的技术，通过杂交瘤技术获得的针对单一抗原决定簇的高特异性抗体。1。细胞融合（1）动物与抗原免疫：加强免疫（2）骨髓瘤细胞：体外无限繁殖并不分泌抗体；HGPRT基因缺失，经8-氮鸟嘌呤培养基筛选；对数期（3）免疫B细胞悬液制备：挤压脾脏（4）饲养细胞：细胞生长需要一定密度；融合细胞大量死亡需要清除；加入同种活细胞（饲养细胞）——小鼠腹腔细胞（巨噬细胞；分泌促细胞生长因子和“清道夫”）；

5、脾脏细胞和成纤维细胞（5）细胞融合：早期用仙台病毒，现在用PEG，使细胞膜上脂质结构重新排列；瘤细胞：B细胞=1：5；加瘤细胞和B细胞对照（6）基础培养系统：胎牛血清；无牛抗体；加抗生素2。选择性培养（1）HAT培养液：细胞合成DNA有两条途径：一为主要途径，利用糖和氨基酸合成核苷酸，氨基碟呤可阻断；二为补救途径，通过磷酸核糖转化酶（HGPRT）或胸腺嘧啶核苷激酶（TK）利用次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷合成核苷酸。所以骨髓瘤细胞缺乏HGPRT和TK，死亡；B细胞具有HGPRT，但在体外不能长期培养，自然死亡；只有杂交瘤细胞从B

6、细胞获得HGPRT或TK基因在HAT培养基上生长繁殖。（2）阳性克隆筛选：用酶联免疫吸附试验（ELISA）检验特异性抗体（3）克隆化培养：1个细胞/孔3。McAb扩大生产：（1）腹腔积液型（2）细胞生物反应器4。McAb鉴定与纯化（1）单克隆抗体的鉴定（2）纯化：辛酸或硫酸铵盐析；二抗采用蛋白A或蛋白G层析Monoclonalantibodies:均一；纯度、效价高；特异性强细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但不能在体外无限增殖；骨髓瘤细胞中只有D途径，可以在

7、体外无限增殖。将这两种细胞在试管中混合，可以获得两两融合的细胞。如何从融合的细胞中分离出杂交瘤细胞？HAT培养基筛选杂交瘤细胞将杂交瘤细胞在细胞培养板上培养。测定时，加入相应的抗原等物质，检测各孔的上清液中细胞分泌的抗体，产生有色反应的为阳性。酶联免疫吸附试验筛选特定的杂交瘤细胞21将杂交瘤细胞（细胞表面携带抗体）固定于微孔板上。测定时，加入抗原、酶标抗体，清洗游离的成分之后，加入酶促反应底物，产生有色反应即为阳性。酶联免疫吸附试验筛选特定的杂交瘤细胞反应底物酶标抗体某种抗原表面抗体21有限稀释法分离单一的杂交瘤细胞阳性

8、孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。