脂肪来源间充质干细胞(ADSC)调控变应性鼻炎模型鼠T细胞免疫状态的分析

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时间:2019-06-25

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1、硕士学位论文探讨ADSC对模型鼠辅助性T细胞、Treg细胞的调节作用及其机制。材料及方法1实验材料及动物胰蛋白酶、DMEM/F12、胎牛血清、青一链霉素双抗、二甲亚砜(DMSO)、胶原酶I型、间充质干细胞成脂/成骨/成软骨诱导分化培养基、Balb/c小鼠、卵清蛋白V级、II级、CM-Dil、Trizol、RT-PCR试剂、逆转录酶、DEPC、MouseIL一4ELISAKit、MouseIL一6ELISAKit、MouseIL—10ELISAKit、MouseIFN—YELISAKit。Balb/c小鼠【6—8周,雄性,体质量

2、18-259,由南方医科大学动物实验中心提供(合格证scxk粤2011-0015)。】2方法2.1ADSC的分离、培养取10只清洁级Balb/c小鼠,断颈处死,完全浸泡于75%酒精中约5分钟消毒,无菌取腹股沟处及附睾周围脂肪组织,剔除肉眼可见的小血管及结缔组织,含高浓度青霉素(300U/m1)+链霉素(300ng/m1)的PBS冲洗3次。眼科剪尽可能剪碎,加入2倍体积的0.1%的I型胶原酶,370c水浴锅中震荡消化约30min,加入2倍体积的PBS液混匀,100目的筛网过滤,1200×g离心lOmin,移液器轻轻吸弃油性上清,

3、沉淀用PBS洗涤3次,含10%胎牛血清的DM两/F12培养基重悬,接种于25mi培养瓶中于37。C5%C02孵箱中培养。24小时后首次换液,以去除残余的红细胞及未贴壁的细胞。以后每2-3天换液一次,细胞长满80%用胰酶消化传代培养。2.2流式检测ADSC的表面标记收集第3~5代ADSC约2×106个,1200×g离心4min弃上清。Buffer溶液重悬,吸取100u1细胞悬液(约3.0X105个细胞)加入Ep管内。加入适量抗体,避光孵育30min。每样品管加入1.5~2miBuffer溶液,1200×g离心4min弃上清。每样

4、品管加入300ulBuffer溶液重悬后流式细胞仪检测。IH中文摘要2.3ADSC成脂、成骨及成软骨诱导分化取生长状态良好的第3~5代ADSC,待细胞达到100%融合时,吸弃旧培养液。先加入2ml/孔的成脂诱导完全培养基A开始诱导,三天后更换为成脂诱导完全培养基B,24h后,再次更换为成脂诱导完全培养基A,如此进行2个循环。继续培养待胞内脂滴已较成熟时,对其进行油红0染色。取生长状态良好的第3~5代ADSC,待细胞达到70~-80%融合时后,吸弃旧培养液,加入2ml/孔的成骨诱导分化完全培养基。每三天换液,直至可观察到明显钙结

5、节。镜下观察见细胞钙结节变多,分化情况较恒定时,进行茜素红染色。取生长状态良好的第3~5代ADSC,消化离心弃上清,按7.5X105/ml加入软骨诱导基础液重悬细胞,1100Xg离心5min;弃上清,按5.0X105/m1加入软骨诱导完全培养液重悬细胞;吸取500皿细胞悬液(即2.5X105个细胞)至15ml离心管中,1100Xg离心5min;离心后不可摇动或吹打细胞团,拧松离心管盖,置于37℃,5%C02中孵育(24h内避免摇动细胞团)。每2~3天半量更换软骨分化诱导液,并轻弹使其脱离管壁悬浮。继续诱导培养待细胞团增大后,送

6、做石蜡切片,进行甲苯胺蓝染色。2.4变应性鼻炎小鼠模型的建立、采用尾静脉注射ADSC处理模型鼠2.4.1致敏液和激发液的配制OVA致敏液:称取卵清蛋白V(0vAV)2mg,溶于4ml无菌PBS液中,常温下震荡溶解配成500ug/ml的OVA溶液;称取适量明矾(氢氧化铝),溶于适量无菌PBS液中,超声波下完全溶解配成10%的明矾溶液,取4ml明矾溶液加入OVA溶液中并充分混匀,用10NNa0H溶液调整PH至6.5,室温静置孵育60min,1200Xg离心5min,吸弃上清,沉淀用无菌PBS液重悬至4ml,涡旋振荡器充分震荡摇匀。

7、OVA激发液:称取卵清蛋白II(OVAII)40mg,溶于lml无菌PBS液中,使用前充分混匀。IV硕士学位论文2.4.2致敏和激发Balb/c小鼠,60只,适应性饲养3d后完全随机分为6组(ft组表示为:致敏/激发/处理),随机选组分别为实验组1(0VA/OVA/高剂量ADSC)、实验组2(ovA/0VA/低剂量ADSC)、实验组3(ovA/0vA/PBS)、实验组4(0VA/0vA/0)、对照组1(PBS/PBS/O)和对照组2(0/0/0)。实验组卜4和对照组1分别于第0、7、14天的相同时间,iml无菌注射器取现配的O

8、VA致敏液和PBS液200ul/只(实验组1-4即lOOug)进行基础致敏。第15-19d,每天相同时间以现配的OVA激发液(和PBS液)20ul(每侧鼻孔lOul,共800ug)进行滴鼻激发。滴鼻结束后立即观察双鼻流涕、挠鼻及喷嚏情况并记录(将其一次性连续多次抓鼻视为一次反

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1、硕士学位论文探讨ADSC对模型鼠辅助性T细胞、Treg细胞的调节作用及其机制。材料及方法1实验材料及动物胰蛋白酶、DMEM/F12、胎牛血清、青一链霉素双抗、二甲亚砜(DMSO)、胶原酶I型、间充质干细胞成脂/成骨/成软骨诱导分化培养基、Balb/c小鼠、卵清蛋白V级、II级、CM-Dil、Trizol、RT-PCR试剂、逆转录酶、DEPC、MouseIL一4ELISAKit、MouseIL一6ELISAKit、MouseIL—10ELISAKit、MouseIFN—YELISAKit。Balb/c小鼠【6—8周,雄性,体质量

2、18-259,由南方医科大学动物实验中心提供(合格证scxk粤2011-0015)。】2方法2.1ADSC的分离、培养取10只清洁级Balb/c小鼠,断颈处死,完全浸泡于75%酒精中约5分钟消毒,无菌取腹股沟处及附睾周围脂肪组织,剔除肉眼可见的小血管及结缔组织,含高浓度青霉素(300U/m1)+链霉素(300ng/m1)的PBS冲洗3次。眼科剪尽可能剪碎,加入2倍体积的0.1%的I型胶原酶,370c水浴锅中震荡消化约30min,加入2倍体积的PBS液混匀,100目的筛网过滤,1200×g离心lOmin,移液器轻轻吸弃油性上清,

3、沉淀用PBS洗涤3次,含10%胎牛血清的DM两/F12培养基重悬,接种于25mi培养瓶中于37。C5%C02孵箱中培养。24小时后首次换液,以去除残余的红细胞及未贴壁的细胞。以后每2-3天换液一次,细胞长满80%用胰酶消化传代培养。2.2流式检测ADSC的表面标记收集第3~5代ADSC约2×106个,1200×g离心4min弃上清。Buffer溶液重悬,吸取100u1细胞悬液(约3.0X105个细胞)加入Ep管内。加入适量抗体,避光孵育30min。每样品管加入1.5~2miBuffer溶液,1200×g离心4min弃上清。每样

4、品管加入300ulBuffer溶液重悬后流式细胞仪检测。IH中文摘要2.3ADSC成脂、成骨及成软骨诱导分化取生长状态良好的第3~5代ADSC,待细胞达到100%融合时,吸弃旧培养液。先加入2ml/孔的成脂诱导完全培养基A开始诱导,三天后更换为成脂诱导完全培养基B,24h后,再次更换为成脂诱导完全培养基A,如此进行2个循环。继续培养待胞内脂滴已较成熟时,对其进行油红0染色。取生长状态良好的第3~5代ADSC,待细胞达到70~-80%融合时后,吸弃旧培养液,加入2ml/孔的成骨诱导分化完全培养基。每三天换液,直至可观察到明显钙结

5、节。镜下观察见细胞钙结节变多,分化情况较恒定时,进行茜素红染色。取生长状态良好的第3~5代ADSC,消化离心弃上清,按7.5X105/ml加入软骨诱导基础液重悬细胞,1100Xg离心5min;弃上清,按5.0X105/m1加入软骨诱导完全培养液重悬细胞;吸取500皿细胞悬液(即2.5X105个细胞)至15ml离心管中,1100Xg离心5min;离心后不可摇动或吹打细胞团,拧松离心管盖,置于37℃,5%C02中孵育(24h内避免摇动细胞团)。每2~3天半量更换软骨分化诱导液,并轻弹使其脱离管壁悬浮。继续诱导培养待细胞团增大后,送

6、做石蜡切片,进行甲苯胺蓝染色。2.4变应性鼻炎小鼠模型的建立、采用尾静脉注射ADSC处理模型鼠2.4.1致敏液和激发液的配制OVA致敏液:称取卵清蛋白V(0vAV)2mg,溶于4ml无菌PBS液中,常温下震荡溶解配成500ug/ml的OVA溶液;称取适量明矾(氢氧化铝),溶于适量无菌PBS液中,超声波下完全溶解配成10%的明矾溶液,取4ml明矾溶液加入OVA溶液中并充分混匀,用10NNa0H溶液调整PH至6.5,室温静置孵育60min,1200Xg离心5min,吸弃上清,沉淀用无菌PBS液重悬至4ml,涡旋振荡器充分震荡摇匀。

7、OVA激发液:称取卵清蛋白II(OVAII)40mg,溶于lml无菌PBS液中,使用前充分混匀。IV硕士学位论文2.4.2致敏和激发Balb/c小鼠,60只,适应性饲养3d后完全随机分为6组(ft组表示为:致敏/激发/处理),随机选组分别为实验组1(0VA/OVA/高剂量ADSC)、实验组2(ovA/0VA/低剂量ADSC)、实验组3(ovA/0vA/PBS)、实验组4(0VA/0vA/0)、对照组1(PBS/PBS/O)和对照组2(0/0/0)。实验组卜4和对照组1分别于第0、7、14天的相同时间,iml无菌注射器取现配的O

8、VA致敏液和PBS液200ul/只(实验组1-4即lOOug)进行基础致敏。第15-19d,每天相同时间以现配的OVA激发液(和PBS液)20ul(每侧鼻孔lOul,共800ug)进行滴鼻激发。滴鼻结束后立即观察双鼻流涕、挠鼻及喷嚏情况并记录(将其一次性连续多次抓鼻视为一次反

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