弓形虫抑制含虫空泡与溶酶体融合机制的初步分析

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1、参考文献--------------------------------------------------------------------------28综述--------------------------------------------------------------------------------31发表及待发表论文--------------------------------------------------------------47致谢---------------------

2、-----------------------------------------------------------481主要缩略语英文索引缩略语全称中文名称AA/aaAminoacid氨基酸Rabras-likeproteininratbrain鼠脑ras样蛋白BSAAlbuminBovineSerum牛血清白蛋白DNAdeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸dNTPDeoxyndeosidetriphosphate脱氧三磷酸核苷酸EEA-1Earlyendosomeantigen-1早内体自身抗

3、原1SNAREsSolubleNSFattachmentprotein可溶性NSF粘附蛋白受体receptorRILPRab7-interactinglysosomalproteinRab7交联溶酶体蛋白mTOR哺乳动物雷帕霉素作用靶mammaliantargetofrapamycin点LBLBmediumLB培养基NCNitrocellulose硝酸纤维素膜PAGEpolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳PBSPhosophatebufferedsaline磷酸盐缓冲液

4、TRAFTNFReceptorAssociatedFactors肿瘤坏死因子受体相关因子rpmRevolutionsperminute每分钟转数SDSSodiumDodecylSulphate十二烷基硫酸钠SDS-PAGESDS-polyacrylamidegeleletrophroresisSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳TBSTris-bufferedSalineTris缓冲盐溶液TBSTTween20/Tris-bufferedSaline吐温20/Tris缓冲盐溶液TrisTris-(Hydroxymethyl

5、)aminomethane三羟甲基氨基甲烷2弓形虫抑制含虫空泡与溶酶体融合机制的初步研究硕士研究生：姜华导师：杨秋林副教授中文摘要目的：以弓形虫PRU-T2株感染巨噬细胞建立体外感染模型，免疫荧光技术检测含虫空泡膜上介导其与溶酶体融合的三种蛋白（Rab5、Rab7、EEA-1）的动态变化。研究弓形虫抑制含虫空泡与溶酶体融合的机制，为阐明弓形虫免疫逃逸的机制及合理设计其疫苗提供实验依据。方法：1建立体外弓形虫感染细胞模型分别培养小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠脾脏巨噬细胞、小鼠肺泡巨噬细胞、RAW264.7鼠传代巨噬细胞，用

6、PRU-T2弓形虫感染细胞（以灭活的PRU-T2弓形虫为阴性对照），分别于30min、60min、90min及120min取出盖玻片，固定，瑞氏染色。比较弓形虫入侵以上4种细胞形成含虫空泡的时间与数量。选择合适的细胞用于下一步研究。2间接免疫荧光技术分别检测Rab5、Rab7、EEA-1在含虫空泡膜上的动态分布取对数生长期细胞消化吹散；将细胞铺于预置有盖玻片的24孔板中，待细胞爬片后将弓形虫加入到孔中感染巨噬细胞；取出盖玻片，用4%多聚甲醛固定10-30min；用0.5%Triton-100处理10-20min；

7、加入2%胎牛白蛋白，37℃温箱中孵育1h封闭；加入适当稀释比的一抗工作液，4℃过夜；洗涤，加二抗，37℃温箱中孵育1h；洗涤，晾干，摄像。结果：1比较了PRU-T2弓形虫感染小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠脾脏巨噬细胞、小鼠肺泡腔巨噬细胞、RAW264.7细胞后对细胞状态的影响及含虫空泡形成的时间与数量。从接种鼠腹腔取出4℃放置1-2天的虫体，分别感染小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠脾脏巨噬细胞、小鼠肺泡腔巨噬细胞、RAW264.7细胞，于30min计数50个细胞中含虫泡的数量分别3是50、10-50、50-80、50-100。2R

8、ab5在含虫空泡膜上持续存在，在热灭活弓形虫吞噬体上随着时间的推移，含量下降直至消失；在含虫空泡膜上检测不到Rab7，在热灭活弓形虫吞噬体膜上Rab7含量升高；EEA1（早内体自身抗原1)在含虫空泡膜上无，在热灭活弓形虫吞噬体膜上存在。结论：1弓形虫侵入RAW264.7细胞形成含虫空泡的时间相对早、数量相对多。且RAW264.7细胞容易培养，所以适合下一步研究。2Rab5