登革病毒2型与其E蛋白与宿主细胞氧化还原状态的关系

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1、第三军医大学硕士学位论文的致病机理和进一步设计新型靶向抗病毒药物提供理论依据。本研究主要结果与结论如下：1．Dv2感染对HepG2细胞内外GSH水平的影响感染组加入Dv2以MOI=10感染HepG2细胞，模拟感染组则加入56℃灭活30觚n的病毒液，同等条件置于37℃，以感染起始记为O时，在感染lOIllin、20min、30rIlin、40血n、60觚“1h、2h、6h、12h、24h、48h(后5个时相点吸附后1h，更换病毒维持液)时，分别用PBS充分洗涤细胞，胰蛋白酶消化，取出细胞。经过四次快速冻融，离心取上清用于GSH的测定。取相同数量的细胞经超声裂解用于测定细胞蛋白浓度。结果发现

2、，病毒感染后10min、20IIlin、30min、40IIlin、60min／lh，HepG2细胞内GSH水平与模拟感染组比较，呈下降趋势，其中以30IIlin下降最为明显，一为16．82±O．86nmol／mg(n=5)，与模拟感染组23．14±1．4lnmol／mg(n=5)和感染组的其他时相点比较均有显著差异(P

3、35．45±3．55nm01／mg(n=5)和22．9l±4．15nmol／mg(n=5)以及感染组的其它时相点比较，差异显著(P0．05)。感染后30min上清中的GSH含量为47．86±3．oonmol／m1(n=4)，较模拟感染组升高33．09％，且有显著差异(P0．05)。以上结果说明DV2感染能够使HepG2细胞内GSH水平下降，改变宿主细胞的氧化还原状态，且呈现阶段性变化，推测可能与病毒的复制过程有关。结合感染后同一时相点细胞外GSH水平的升高和文献报道，

4、推测DV2感染后30min细胞内GSH水平的快速降低可能是由于DV2感染所致细胞膜通透性增加、GSH的外漏引起的。2．Dv2E蛋白对宿主细胞内外GSH水平的影响首先构建了稳定表达E蛋白的HepG2细胞株pRe．E／HepG2，并且通过PCR、酶切、核苷酸测序及间接免疫荧光法进行了鉴定和检测，确认了该细胞中E蛋白的表达。同时构建了稳定转染空质粒的细胞株pRe．E／HepG2作为对照。然后测定了pRe．E／HepG2细胞内外GSH的水平。结果：pRe—E／HepG2细胞内GSH水平与pRe／HepG2细胞对照组比较，呈下降趋势。pRe一阴epG2细胞内GSH平均浓度为25．61±2．23nm

5、01／mg(n=4)，pRe／HepG2细胞内的GSH平均浓度为33．38±1．07nmo№g(n=4)，与pRe／HepG2细胞比较，pRe．E／HepG2细胞内GSH下降了24．3％(P

6、5％。以上结果表明，稳定表达E蛋白的pRe—E／HepG2细胞较稳定转染空质粒的pRe／HepG2细胞，细胞内外GsH浓度均下降显著，提示E蛋白在宿主细胞中的表达不仅可以改变细胞内的氧化还原状态，还可以使宿主细胞外的GSH水平降低，在DV2感染诱使的细胞氧化还原状态变化的过程中，E蛋白可能起重要作用。3．BSO及外源性GSH处理对DV2感染的影响依据MTT实验结果并参照文献，选择BS0的处理浓度为0．2mM和lmM，外源性GSH的处理浓度为10mM和20mM。在不感染病毒的情况下，培养上清中加入O．2mM、lmMBsO处理18h，可使细胞内GSH含量由空白对照组的24．53±2．59nm

7、ol／mg(n=5)分别下降至14．29±1．48nmol／mg(n=5)、14．05±1．93nmol／mg(n=5)(PO．05)，幅度平均为42．24％(n-5)。在DV2感染+Bs0处理组，感染前18h分别用0．2InM、1n心订BS0预处理HepG2细胞，然后用DV2以MoI=1感染HepG2细胞，并维持Bso浓度至感染24h，空白对照组不加药物处理。感染后24h收取病毒上清