登革病毒包膜e蛋白ⅲ区抗体中和表位与功能研究

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1、南方医科大学2009级博士学位论文登革病毒包膜E蛋白III区抗体中和表位与功能研究NeutralizingepitopesandfunctionalstudyofantibodiesagainstenvelopeproteindomainIIIofdenguevirus课题来源：国家杰出青年科学基金(30725031)“重大传染病防治"科技重大专项(2009ZXl0004．306)国家自然科学基金联合基金(U1132002)学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院李孝权车小燕研究员临床检验诊断学委托培养博士第二临床医学院2013年5月

2、2目广州博士学位论文登革病毒包膜E蛋白III区抗体中和表位与功能研究博士研究生：李孝权指导教师：车小燕研究员摘要登革病毒(DENV)是引起人类疾病的蚊传播病毒，它能导致无症状感染、登革热(DF)和更严重的登革出血热(D邯)或登革休克综合征(DSS)。登革疾病的负担在热带和亚热地区日益增加，特别是在南美、东南亚和加勒比地区，在非洲和中东的报道也越来越多。而在我国南方地区，几乎每年都发生DF流行。登革疾病的流行形势越来越严峻，其致病机理还没有完全弄清楚，但是病毒、宿主的免疫史和个体的遗传背景在登革严重疾病的发生中都起着重要作用。其中，病毒本身的作用

3、很关键。任何一种血清型DENV造成的初次感染都可能使个体在感染不同于初次感染的异型血清型(heterotypicserotype)DENV时，病毒载量增加、潜伏期缩短，从而引起DHF／DSS的机率也大大增加。这与引起再次感染的病毒血清型、基因型、病毒序列以及初次与再次感染的间隔时间都有关系。为应对日益增加的登革疾病，很多研究机构都在加紧研发登革疫苗。目前，已经有几类疫苗在进行临床前的评价，包括减毒活疫苗、灭活病毒疫苗、基于重组蛋白的亚单位疫苗和裸DNA疫苗等。由于采用基于减毒活疫苗的传统方法，还没有研制出可批准使用的疫苗，研究者更多地将目光转向

4、重组亚单位疫苗。摘要尽管研究登革疫苗是可行的，但是其研发还是面临着相当严峻的挑战：(1)登革疫苗必须能对4种血清型DENV的感染同时提供保护作用，因而需要研制四价疫苗；(2)登革疫苗要能提供长期的保护。因为有研究报道，初次感染20年以后的再感染时仍会发生DHF；(3)还没有合适的复制登革疾病的动物模型；(4)尽管中和抗体的保护性作用已广为接受，但其与实际保护效果的关系仍需确定；(5)在DEN的传播模式和病毒株改变时，登革疫苗需要重新评价。因此，要研制出可靠的登革疫苗，就要解决两方面的难题：一是疫苗的效果，主要指疫苗的保护性；二是疫苗的安全性问题

5、。DENV的包膜由脂质双层构成，含有两类包膜相关蛋白：膜蛋白(envelope，E)和M蛋白(membrane，M)。E蛋白通过结合到细胞受体而参与病毒的吸附及穿入后与内吞体的融合。E蛋白含有3个不同的结构域：结构域I(EDI)、EDII、EDIII。EDIII在病毒颗粒表面是暴露且可及的，而且，重组EDIII也能抑制病毒的感染性。多项研究发现，EDIII含有单一血清型特异性(type．specific，TS)表位、针对2～3种血清型DENV的亚复合体反应(sub．complexreactive，sCR)表位以及同时针对4种血清型DENV的复合

6、体反应(complexreactive，CR)表位，多株鼠源单克隆抗体也分别定位到这些表位。研究表明，许多TS和sCR鼠单抗是针对DENV单抗中起主要中和及保护作用的单抗。由此，登革病毒EDIII蛋白也成为亚单位疫苗很有前景的备选靶标。另外，最近有关人源单抗的研究认为，针对EDIII的单抗仅占人免疫血清中抗DENV总抗体中的很小一部分，而且EDIII上的表位不是人抗DENV中和抗体的主要靶标。尽管如此，鼠源单抗的抗原性表位及其中和活性谱仍有许多方面未研究清楚，更加深入的研究对加深了解体液免疫反应的复杂性、改善登革疫苗的免疫策略或研究治疗性抗体均

7、有不可替代的作用。对EDIII单抗的抗原性表位和中和活性的研究可加深对疫苗效果的研究，但是，还有一个难题就是疫苗的安全性问题。前已述及，任何一种血清型登革病毒引起初次感染后，由不同血清型引起再次感染时，登革疾病加重的机率大大II博士学位论文增加，其背后最主要的机制就是抗体依赖的增强作用(antibody—dependentenhancement，ADE)，即先前存在交叉反应弱中和抗体能与登革病毒结合，增强表达Fc),R受体的细胞的感染水平。最近，DejrtirattisaiW．等的研究成果也呈现出ADE发生的复杂性，即抗E蛋白抗体和抗前膜(pr

8、ecursormembrane，prM)抗体均能增强DENV感染。要研制能提供长期保护的四价疫苗，还没有合适的登革疾病的动物模型对登革疫苗进行安全性评