呕吐毒素标准检测规程

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1、文件编号：HAMK-OI--2015版本号：1.0生效日期：2015年12月30日发放号：呕吐毒素标准操作规程1、目的为了规范亲和柱净化样本中呕吐毒素的操作流程，特制订本操作规程。2、范围本标准适用于粮食、饲料、食品中呕吐毒素的检测。3、检出限和定量限项目岛津安捷伦样本检出限（µg/kg）样本定量限（µg/kg）样本检出限（µg/kg）样本定量限（µg/kg）DON12.9636.721515034、职责部门名称部门职责质量管理部1、负责本制度的实施。2、负责本制度的监督执行。5、程序5.1原理测定的基础是抗

2、原、抗体反应，抗体连接在柱体内，样品经过提取、过滤后，缓慢的通过呕吐毒素免疫亲和柱，在免疫亲和柱内毒素与抗体结合，之后洗涤免疫亲和柱除去没有被结合的其他无关物质。用甲醇洗脱呕吐毒素，然后注入到分析仪器中用于检测。5.2溶液配制5.2.1PBS缓冲液：称取8.0g氯化钠，1.2g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，用990mL蒸馏水或去离子水溶解，用浓盐酸调节pH至7.0，再用蒸馏水或去离子水定容至1L。上述PBS缓冲液用于样品的提取、稀释，以及亲和柱的清洗。5.2.2呕吐毒素标准工作液：先用色谱级

3、甲醇将高标稀释到5ppm，再用水将其稀释到1ppm，此时标品的溶剂为20%甲醇，然后再用20%甲醇将标准品梯度稀释到500ppb、200ppb、100ppb、50ppb。5.3样品前处理5文件编号：HAMK-OI--2015版本号：1.0生效日期：2015年12月30日发放号：5.3.1玉米、小麦、面粉、配合饲料、浓缩料、精补料等吸水性较小的样本----将样品粉碎，称取25g样品，加入5g聚乙二醇，加入125mL蒸馏水；----高速均质（≥10,000r/min）1min（或用摇床200r/min～300r/

4、min剧烈振荡20min）；----用快速定性滤纸过滤，收集滤液；----滤液再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；----取2.5mL上样液过免疫亲和柱净化。稀释倍数：25.3.2麸皮、豆皮、玉米胚芽粕、米糠等吸水性较强的样本----称取10g样品，加入100mL蒸馏水；----高速均质（≥10,000r/min）1min（或用摇床200r/min～300r/min剧烈振荡20min）；----用快速定性滤纸过滤，收集滤液；----滤液再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；----取5mL上样液过免

5、疫亲和柱净化。稀释倍数：25.3.3酒类----取脱气的酒类样品（含二氧化碳的酒类样品，使用前先搅拌或超声脱气）或不含二氧化碳的酒类样品25g，用PBS缓冲液定容至100mL；----高速均质（≥10,000r/min）1min（或用摇床200r/min～300r/min剧烈振荡20min）；----用快速定性滤纸过滤，收集滤液；----滤液再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；----取2mL上样液过免疫亲和柱净化。稀释倍数：25.3.4酱油、醋、酱及酱制品----取样品25g，用PBS缓冲液定容至10

6、0mL；----高速均质（≥10,000r/min）1min（或用摇床200r/min～300r/min剧烈振荡20min）；----用快速定性滤纸过滤，收集滤液；5文件编号：HAMK-OI--2015版本号：1.0生效日期：2015年12月30日发放号：----滤液再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；----取2mL上样液过免疫亲和柱净化。稀释倍数：25.4净化----取出免疫亲和柱，将上方塞子取出斜剪断，再插回亲和(3mL的免疫亲和柱去掉上方塞子，安装上转接头，将转接头另一端与注射器固定后使用)--

7、--将柱子与气控操作架上的注射器连接固定，取适量处理后的溶液上样；----去掉亲和柱下方堵头，调节开关，使液体以1～2滴/秒的速度流出；----待液体排干后，方法5.3.1中的样品用蒸馏水或去离子水洗涤2次，每次10mL，其余样品首先用0.1%Tween-20水溶液洗涤10mL，再用蒸馏水或去离子水洗涤10mL，流速2～3滴/秒；----待液体排干后，上样1mL甲醇，流速1滴/秒，收集洗脱液并在50～60℃加热条件下N2气吹干，然后用1mL流动相（20%甲醇）复溶；----复溶液用0.22μm微孔滤器过滤后转

8、移至样品瓶中用于HPLC分析。*每次上样前都要将上次液体完全排干。5.5液相测定5.5.1液相色谱条件C18柱：250mm（长）×4.6mm（直径），填料粒径5μm；流动相：20%甲醇流速：1.0mL/min；柱温：40℃；进样体积：50µL紫外检测器：218nm5.5.2色谱定量分别取相同体积样液和标准工作液注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定试样的响应值（峰高或峰面积），以标准品浓度为横坐标