放射配基分析法对人食管下括约肌M受体与配基亲和力的研究

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1、河北医科大学硕士学位论文放射配基分析法对人食管下括约肌M受体与配基亲和力的研究姓名：张洪雷申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：刘俊峰20080301河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师(或指导小组)的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署名单位为河北医科大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则，承担相应的法律责任。研究生签名石墙：爱识师签名：乡讥≯氛院领导签名：瑚罗年弓月们日研究生学位论文独创

2、性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。研究生签名乏老珐穆导崾签名：?俨罗年岁月y{『日中文摘要放射配基分析法对人食管下括约肌M受体与配基亲和力的研究摘要目的：食管下括约肌(LES)是食管胃连接部特殊增厚的肌束，由位于胃小弯侧呈半环形的钩状纤维(claspfibres)幂l位于大弯侧呈斜行分布的套索纤维(slingfbres)共同构成，这两束肌纤维协同维持LES的关闭状态，并在食管胃结合部形成LES高压带。人体LES起着单方向开放的括约肌作

3、用，正常状态下，由于高压带的阻隔胃内容物不能反流入食管，另一方面，由于LES高压带的适时降压开放允许了食物继续下行入胃，或者呕吐的发生和胃内气体的排出。LES的收缩和舒张功能调节机制非常复杂，包括了神经、体液及自身肌源性等多种因素。乙酰胆碱是控制LES收缩的最主要神经递质，它通过分布在平滑肌纤维上的毒蕈碱型受体(M受体)起调节作用。M受体广泛存在于全身各平滑肌中，包括胃肠道，它在维持全身平滑肌收缩状态时起主要作用。目前M受体家族移交明确的按药理分型为M1、M2、M”M4，或按分子生物学分型为ml、m2、m3、m4和m5五种亚型。其中主要分布在平滑肌纤维膜上的主要M受体亚型为M2和M3，M2

4、数量占75％一80％，但M3受体是主要功能类型。本试验采用放射性配基受体结合分析法(RadioLigandBindingAssay,RLBA)研究人食管下括约肌M受体与其配基的亲和力，以进一步探讨M受体及其亚型在人LES调节机制中听发挥的作用。中文摘要方法：选取2007年5月至2007年12月在河北医科大学第四医院因高位食管中段癌行食管大部切除术患者8例，采集未受侵的套索纤维和钩状纤维，制成约(2-4)mm×(8-二12)mm的肌条，1)4"C条件下用组织匀浆器加入TBS液匀浆，匀浆液(4℃，1000×g)离心10分钟。2)弃上清后，以美国PIERCE公司的膜蛋白提取试剂盒将沉淀运用膜蛋白

5、萃取法制备受体膜蛋白，反应缓冲液稀释，考马斯亮蓝G．250定量，然后存于．80。C备用。3)以3H．QNB为标记配基，Atropine为拮抗剂，反应体系总体积250lal，使得3H．QNB与M受体充分结合，37。C恒温孵育40min，，进行饱和试验。4)以Methoctramine和4一DAMP为M2和M3受体拮抗剂，以上述反应体系重复前面的过程进行竞争抑制试验。5)以49型玻璃纤维滤膜采用负压抽滤的办法分离结合和游离配基，将含有结合配基的受体的滤膜置于液体闪烁计数仪中计数。实验结果采用GraphpadPrism4．03软件绘制浓度效应曲线及竞争抑制曲线，并计算平衡解离常数Kd，最大结合量

6、Bm。x和半效抑制浓度IC50；用SPSS13．0软件分析实验结果，以P≤O．05有显著性差异。结果：1．饱和结合试验：分别得出M受体在套索纤维和钩状纤维的饱和曲线，并得出在LES的套索纤维上3H。QNB与M受体的最大结合量Bm。x8为568．2+5．28cpm，平衡解离常数Kd。为1．049土0．054mmol／L，而在钩状纤维上二者的最大结合量Bm觚c为557．9士10．41cpm，Kdc为1．033土0．045mmol／L。M受体与3H．QNB的最大结合量在中文摘要钩状纤维和套索纤维上无统计学差意义(t=0．782，p=O．391)，平衡解离常数在钩状纤维和套索纤维上无统计学差意义(

7、t=O．395，p=0．540)。2．竞争抑制实验：得出M2受体和M3受体拮抗剂分别在套索纤维和钩状纤维的竞争抑制曲线，同时在LES的套索纤维上Methoctramine的半量有效抑制浓度IC50№№c嘞me为5．422+0．112x10～mol／L，4一DAMP的半量有效抑制浓度Ic504巾AMP为1．658士0．071×10～mol／L，二者对3H—QNB和M2、M3受体结合的抑制作用有统计学差异(t=6．26，p=