沉默N-乙酰糖基转移酶V抑制CNE-2细胞的增殖和转移能力

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1、中文摘要化的分子基础研究n1。而异常糖基化常因肿瘤细胞高尔基体上的糖基转移酶表达水平改变所致。N一糖链分支增多常与肿瘤的转移相关，如N一乙酰氨基葡萄糖转移酶(GnT—V，Mgat5，能够催化形成形成13l，6一乙酰氨基葡糖分支结构)。许多研究以表明，GnT—V活性增高以及其糖基化产物增多与细胞活力、浸润能力、以及转移能力密切相关。GnT—V活性在许多恶性肿瘤组织中表达增高，如乳腺癌、肝癌、神经母细胞瘤、胆管癌以及鼻咽癌等，但是在非小细胞肺癌中恶性程度越高，其表达量越低嘲。关于RNA干扰(RNAinterfering，RNA

2、i)现象是由与靶基因序列同源的双链RNA(double—strandedRNA，dsRNA)引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。细胞中的核糖核酸酶III家族成员之一的，dsRNA特异性的核酸酶Dicer将dsRNA裂解成由21-25个核苷酸组成的小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)，随后siRNA作为介导子引起特异性地降解相同序列的mRNA，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制阳吲。肿瘤分子靶向治疗是指在肿瘤分子细胞生物学的基础上，利用肿瘤组织或细胞所具有的特异性(或

3、相对特异的)结构分子作为靶点，使用某些能与这些靶分子特异结合的抗体、配体等达到直接治疗或导向治疗目的的一类疗法。分子靶向药物以某些肿瘤细胞膜上或细胞内特异性表达的分子为作用靶点，从而能够更加特异性地作用于特定肿瘤细胞，阻断其生长、转移或诱导其凋亡，抑制或杀死肿瘤细胞，达到控制肿瘤的目的[H1。二、研究目的鼻咽癌是我国的高发肿瘤，目前关于GnT—V表达与鼻咽癌关系的相关研究较少，本试验利用RNAi原理及技术，合成针对多数肿瘤细胞鼻咽癌中高表达基因GnT—V的shRNA表达质粒，将其转染人鼻咽癌细胞株CNE-2，观察GnT—V

4、的表达变化对鼻咽癌细胞株体内增殖及转移能力的影响。目的就在于能否在鼻咽癌的分子靶向治疗中找到一个新的靶点，并提供客观试验依据。三、实验方法Ⅱ硕士学位论文1、G11T．VshRNA质粒制备：由上海吉玛公司完成。2、细胞培养：转染成功的人鼻咽癌细胞株CNE．2／NC、CEN．2／2224在37℃5％C02条件下，培养于含10％新生牛血清及2000ug／mlG418的RPMI．1640中，每周传代2"--3次。CNE．2细胞培养至对数生长期。3、裸鼠皮下成瘤实验取对数生长期的细胞，调整细胞浓度为2．5×107／mL，按1001x

5、L／只进行臀部皮下注射。左臀部-阴性对照组(CNE．2／NC)，右臀部：干扰组(CNE．2／2224)。每组4只。在2周内每隔2天测量瘤体的长径、短径，观察瘤体体积大小变化。瘤体体积=短径2×长径／2。4、肝脏异位种植肺转移裸鼠模型每组5只裸鼠，10％水合氯醛1001xL／只行腹腔内麻醉。取对数生长期的细胞，调整细胞浓度为5X107／mL，按509L／只进行肝脏注射。其后继续在SPF条件下饲养。接种后2周处死裸鼠，打开腹腔，肉眼观察肝脏有无癌灶、肺脏有无转移灶，所有肝脏种植瘤及转移瘤均经病理切片HE染色，了解有无瘤体形成；

6、并用RealTimeRT-PCR、Westernblot、免疫组化检测GnT-VmRNA、蛋白表达水平有无改变；以及免疫组化检测E．cadherin及bcl．2的表达情况。(1)RealTimeRT-PCR测定肝脏种植瘤中GnT-V的mRNA表达情况用Trizol提取肝脏种植瘤组织总RNA，采用AMV逆转录合成cDNA．GnT-V上游引物为5’GAGCAGATCCTGGACCTCAG37，下游引物为57GCTGTCATGACTCCAGCGlA37。使用13．actin作为内参，上游引物为5’G丸讼C1’ACCTTCAACT

7、CCATC3’，下游引物为57CGAGGCCAGGATGGAGCCGCC37。反应条件为：95℃预变性30s，PCR：94℃5s，60℃30s，共40个循环，溶解曲线：95℃0s，65℃60s，95℃0s．基于目的基因和看家基因实时荧光定量扩增曲线得到Ct(C为Cycle，t为threshold)值，ACT代表目的基因相对于内参基因的表达强度，公式为△CT=Ct目的基因．Ct内参基因。用Folds=2．AACt表示实验组目的基因与对照组目的基因表达量的倍比关系，△ACt=ACT实验组．ACT对照组。目的基因为GIlT．V，

8、III誊中文摘要内参基因为13一actin。(2)Westernblot检测GI：IT-V蛋白表达提取肝脏种植瘤总蛋白，用测定蛋白浓度，吸取50I-tg总蛋白，去离子水补至20}tL，加入等体积2×上样buffer煮沸7min，离心后吸取30此上样，经不连续SDS．PAGE电泳分离后，用半干法电转移至P