肠三叶因子在毕赤酵母中的表达、纯化及肠三叶因子受体的初步研究

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1、第三军医大学硕士学位论文肠三叶因子在毕赤酵母中的表达、纯化及肠三叶因子受体的初步研究姓名：张勇申请学位级别：硕士专业：外科学（烧伤）指导教师：彭曦20071101第三军医大学硕士学位论文肠三叶因子在毕赤酵母中的表达、纯化及肠三叶因子受体的初步研究要背景：肠三叶因子(intestinaltrefoilfactor，ITF)是由肠道杯状细胞特异分泌的具有特殊空间结构的小分子多肽⋯，ITF不仅能促进细胞增殖和移行，还由于其空间结构中有和粘蛋白的寡聚糖或多糖侧链结合的位点，使之形成稳定的凝胶复合物，稳定肠粘

2、液层。此外，ITF具有蛋白酶水解抗性和酸碱稳定性，可减轻多种致伤因子造成的消化道损害，这些特性决定了ITF在肠道的自我保护机制中占重要地位。目前对ITF的研究已很深入，但有关ITF受体的研究相对滞后，ITF是否具有独特的受体存在争议，一些学者认为ITF没有特异受体，它依赖表皮生长因子受体(EGFR)发挥生物学效应[2】；另一些学者则持不同观点，他们发现了一类能和ⅡF特异结合的蛋白，将其称之为ITF结合蛋白，并对蛋白的基本特性进行了初步分析【3】，但这些蛋白是否就是ITF受体还缺乏具有说服力的直接证据

3、。目的：在成功获取重组表达ITF的基础上，通过配体受体动力学研究和受体定位研究，探索在肠上皮细胞上是否存在ITF特异受体，以及受体在细胞上的分布特点。方法：1．ITF在酵母中的表达和纯化：将成功转化的含ITF成熟肽序列的酵母X一33菌株进行zeocin筛选，将阳性转化子接种于YPD液体培养基中摇瓶表达，表达产物上清经硫酸铵分级沉淀、Ni—NTA亲和层析、超滤离心三步纯化以获取重组表达的ITF。TricineSDS—PAGE及Westembloting鉴定重组蛋白。2．肠三叶因子受体放射性配基结合实验

4、(Radioligandbindingassay，RLBA)：摸索ITF受体放射性配基结合分析的最佳反应温度、时间、细胞浓度和非标记rrF的浓度。在此条件下在IEC一6细胞上进行ITF受体放射性配基结合实验，得到亲和常数(‰)及最大结合容量(曰m。。)。在相同的条件下对HT-29、5E6L、HaCat细胞上ITF受体进行分析，比较不同细胞上ITF受体的差异。通过大量EGF、ITF及EGFR阻断肽对ITF受6第三军医大学硕士学位论文体和EGF受体竞争抑制，证实ITF特异受体的存在。3．肠三叶因子受体在

5、肠上皮细胞上的定位：将传代培养的IEC一6细胞用O．5％的胰酶消化后，细胞浓度调为约2．5×105个／ml，加入放有8×8mm盖玻片的24孔板于37℃，5％C02培养箱孵育，待IEC一6肠上皮细胞贴壁，细胞爬片用PBS清洗3遍后与B一藻红蛋白(B—PE)标记的ITF(BPE—ITF)在4℃下分别共同孵育O．5，1．0，2．0，4．Oh，孵育结束后PBS清洗3遍×3min，细胞片置于载玻片上并用90％缓冲甘油封片，激光共聚焦显微镜下观察ITF受体在IEC一6细胞上的分布规律。并使用过量的EGF、ITF

6、和EGFR阻断肽进行竞争抑制实验，观察荧光的变化情况。结果：1．酵母表达获得ITF，产物经TricineSDS—PAGE、Westemblot鉴定具有良好的抗原性和特异性，三步纯化后重组蛋白的纯度超过95％，表达量达到约50mg／L。2．放射性配基结合实验最佳反应条件为4℃，9呼育30min，细胞浓度为5．O×105个／ml，非特异结合配基浓度为标记配基的10000倍。在此条件下，对ⅢC一6、HT．29、5E6L和HaCat细胞上ITF受体进行放射性结合分析，并通过Scatchard线性回归分析得到

7、IEC一6细胞最大结合容量曰m。。=62．713×106结合位点／细胞，亲和常数‰=4．3478×10。10mol／L；HT-29细胞最大结合容量Bm。。=61．1583×106结合位点／细胞，亲和常数‰=O．8849×10。10mol／L；5E6L细胞最大结合容量Bm。。=184．89×106结合位点／细胞，亲和常数‰=3．448×10。10mol／L。根据所得到的‰值和Bm。。分析，ITF与ⅢC一6、HT_29、5E6L细胞结合呈高亲和力，但受体密度有所差异。表皮细胞HaCat与ITF结合呈低亲

8、和力。EGF对ITF受体及rrF对EGF受体均无竞争抑制作用，EGFR阻断肽对ITF与IEC一6细胞的结合并未受影响。3．激光共聚焦观察发现，荧光标记的ITF首先聚集在细胞膜上，随时间和浓度的增加，荧光标记的ITF逐渐向胞浆与胞核转移。过量的ITF可明显抑制荧光标记的ITF与细胞结合，荧光强度明显降低。EGF和EGFR阻断肽对ITF在细胞膜上的荧光强度和向胞浆、胞核的转移没有影响。结论：1．重组表达的ITF产量约50mg／L，纯度>95％，符合受体研究中对配体的要求。