应用PicoGreen荧光染料进行DNA精确定量

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1、应用PicoGreen荧光染料进行DNA精确定量关键词:Picogreen荧光染料DNA定量DNA精确定量点击:1380作者:原平皓生物简介：对微量的双链DNA进行定量在各种生物学应用中都显得非常重要,例如cDNA文库的构建；用于亚克隆的DNA片段的纯化；定量DNA扩增产物,在药物中DNA分子残留的测定等。检测核酸浓度最常用的方法就是检测核酸在260nm(A260)处的光吸收，这一方法主要的缺点是单链核苷酸和单核苷酸会产生干扰信号，核酸样品中的杂质也会影响结果。光吸收不能区分DNA和RNA,灵敏度也相对较低(用1cm的比色杯在A26

2、0值为0.1时相对应的双链DNA浓度为5μg/ml)。Picogreen染料是一种新型的dsDNA染料：其检测灵敏度高，可检测到pg级DNA；检测范围宽，可跨越４个数量级；特异性好，基本不受ssDNA和RNA的影响，并且可以耐受一定浓度的盐、尿素、乙醇、氯仿、去垢剂、蛋白等干扰。目前使用Picogreen染料定量检测DNA已经广泛用于生物学检测，并被2010年版《中华人民共和国药典》选为药物残留DNA定量方法。原理：检测方法：2．所需器材lModulusTM单管型多功能检测仪（9200-003）l微量适配器（9200-928）l微量

3、比色皿lPicoGreen试剂3．试验方案3.1试剂准备PicoGreen是以1mL的浓缩液形式保存在无水的DMSO（二甲基亚砜）中。实验当天，配制2×PicoGreen试剂的工作溶液，用1×TE按1:200的比例稀释浓缩液（10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH7.5）。如果要准备足够的工作溶液测定20个样品，可在20mL1xTE中加入100μLPicoGreendsDNA定量试剂。由于试剂容易吸附到玻璃表面，要在塑料容器中配制。PicoGreen试剂见光易降解，所以应将配好的溶液用箔包住或放置暗处避光保存。溶液最好在配制

4、好数小时内使用，以保证最佳结果。3.2DNA标准曲线3.2.1标准品工作液的配制：Sigama小牛胸腺嘧啶DNA干粉（货号：D4522-1MG）1mg（Tris，Nacl等浓度已成标准体系），加入1mL双蒸水，配制成1mg∕mL的标准品工作液；3.2.2标准品工作液稀释：（1）母液稀释：取10ul（1mg∕mL）标准品工作液加入到990ulTE溶液中，浓度稀释成10ug∕mL，取10ul（10ug∕mL）标准品工作液加入到990ulTE溶液中，浓度稀释成100ng∕mL；（2）倍比稀释：取800ul（100ng∕mL）的标准品工作液

5、加入到200ulTE溶液中，浓度达到80ng∕mL（药典规定：荧光染色方法DNA含量在1.25-80ng/mL范围线性较好,该法DNA检出限为0.3ng/ml），取500ul（80ng∕mL）的标准品工作液加入到500ulTE溶液中，浓度稀释到40ng∕mL；依次倍比稀释，配成20ng/ml、10ng/ml、5.0ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml的标准品溶液；3.2.3标准曲线的制备：倍比稀释后的各梯度标准品溶液和染料工作液各取100ul混匀，避光室温放置5min。3.2.4使用ModulusT

6、M单管型多功能检测仪的Blue荧光模块检测样品的荧光值：将混合后的溶液加入微量比色皿，确信不要在样品中引入气泡，轻轻地弹微量检测皿的外部，可以驱散气泡。以1×TE缓冲液为blank，测定样品和空白对照的荧光值；用标准品溶液的浓度（ng/ml）对应的荧光强度作直线回归，制备标准曲线4样品分析在每个样品中加入等体积的2×PicoGreen工作溶液（3.1节准备），充分混匀，避光于室温下孵育5分钟。将孵育好的溶液加入微量比色皿，使用ModulusTM单管型多功能检测仪检测其荧光值。将样品溶液的荧光强度代入回归方程，求出样品的残余DNA含量

7、（ng/ml）。