实时荧光定量PCR技术,原理,应用及实践,第二代染料

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3、ingofnovelpsychoactivesubstancesBeliefinastrologyPCR：理想与现实反应效率差异的累积使终点定量几乎不可能终点检测，与看家基因对照，所谓‘半定量’：不可接受。确定模板初始数量‘real-time’使qPCR成为可能模板DNA量越多，荧光强度达到检测域值所需的循环数越少，即Ct值越小模板Log浓度与Ct值呈线性关系Real-timePCR应用定量–基因表达水平检测定量–基因拷贝数检测多色标记–SNP检测高精度溶解曲线分析（HRM）-SNP高精度溶解曲线分析

4、（HRM）-DNA甲基化分析Real-timePCR:发光原理非特异染料（SYBRGreen，SuperGreen）水解探针（TaqMan探针）非水解探针（Molecularbeacon，Scorpionprimer）染料法qPCR基因表达水平检测内参基因(housekeepinggene)选择样本处理与RNA提取–cDNA–qPCR墨菲定律：Anythingcangowrongthatwillgowrong!以各自样本中内参（housekeeping）基因为标杆，比较两样本中目的基因的相对丰度-ΔΔC

5、t法成立条件：内参基因(houskeepinggene)在相互比较的样本之间表达丰度相同满足条件：内参基因和目标基因的扩增效率接近-正负10%染料法qPCR相对定量HousekeepinggeneselectionHousekeepinggene的概念与定义不同环境，不同生长与病理状态，不同器官、组织、细胞类型之间表达水平恒定β-ActinandGAPDHhousekeepinggeneexpressioninasthmaticairwaysisvariableandnotsuitablefornorm

6、alisingmRNAlevels.Thorax2002;57:765-770HousekeepinggeneselectionEvidenceBasedSelectionofHousekeepingGenesPLoSONE.2007;2(9):e898Housekeepinggeneselection文献检索，挑选恰当housekeepinggene恰当：有文献表明某基因在给定研究条件下适合用作Housekeepinggene没有文献表明某基因在给定研究条件下不适合用作Housekeepinggene

7、（特别是β-Actin和GAPDH）Housekeepinggene在给定研究条件下的表达丰度最好与目标基因相似通过实验选择Housekeepinggene实测多个备选Housekeepinggene以各备选基因的几何平均数为均一化标准，检验各基因在给定条件下的表达稳定性参考资料geNorm网站-http://medgen.ugent.be/~jvdesomp/genorm/Vandesompeleetal.,GenomeBiology,2002,'Accuratenormalizationofreal

8、-timequantitativeRT-PCRdatabygeometricaveragingofmultipleinternalcontrolgenes'HousekeepinggeneselectionHousekeepinggene康为产品高丰度ACTB，GAPDH中等丰度beta2M低丰度HPRT1染料法qPCR基因表达水平检测内参基因选择样本处理与RNA提取–cDNA–qPCR样本处理与RNA提取外界刺激–10分钟–可检测的表达改