《精氨酸激酶AK》PPT课件

《《精氨酸激酶AK》PPT课件》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、精氨酸激酶(AK)的表达及其纯化目录研究背景1实验材料2实验方法3结果及分析4蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化是对蛋白质进行研究的一项必需的和基础的工作。目前常使用的分离纯化的方法或技术都是在了解蛋白质性质和结构特点的基础上建立的。目标蛋白质的分离决不是一件轻而易举的事情，因为要把它与性质、大小和结构十分相似的其他蛋白质分离开来存在许多困难。有些目标蛋白质在组织细胞内的含量很低，这无疑将增加获取足量蛋白质的难度。▲目标蛋白质的分离纯化程序主要包括:⑴材料的选择；⑵组织匀浆和破碎细胞获取粗提取液；⑶蛋白质初步提纯；⑷选择一种或几种合适的方法除去杂蛋白,直

2、至完全纯化；⑸目标蛋白的鉴定。用于研究目的蛋白质通常应保持它的生物活性。因此，在目标蛋白质的整个分离纯化过程中要在较低温度下(0－4℃)操作，注意使用蛋白酶(使蛋白质降解的酶)的抑制剂，避免使用剧烈条件，以免蛋白质特定的折叠结构受到破坏。一、蛋白质是两性电解质根据蛋白质的分子结构，很容易得出构成蛋白质的两性解离的基础是氨基酸残基的侧链可解离的基团。作为两性电解质，每种蛋白质都有其等电点(pI)，这与它所含的氨基酸种类和数量有关。所有的蛋白质，不管它具有什么样的功能，都能在细胞内起一定的缓冲作用。1.蛋白质的电泳分离凝胶电泳是目前常用的一种生化方法。用于

3、蛋白质分离的凝胶主要是聚丙烯酰胺凝胶，该凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺配制而成，其最大的特点是凝胶的孔径可根据需要进行选择。以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，可进行非变性电泳和变性电泳。1透析2层析原理3凝胶过滤4离子交换层析5亲和层析6电泳主要内容1透析按照分子大小进行分离。分离取决于透析袋截留的分子量。透析液浓缩的蛋白混合样品透析袋开始透析处于平衡状态层析也称之色谱，基本原理是分析样品作为流动相流过固相时，由于样品中的各个成分与固相相互作用不同使得样品中的各个成分通过固相的速率产生了差别，从而达到分离样品中各个成分的目的。层析因固相介质不同又分

4、为离子交换层析、分子筛层析和吸附层析等各种层析。2层析原理将作为固相成分的不溶性基质，例如葡聚糖凝胶、纤维素、树脂等填充到柱子中，用平衡液平衡。然后加样品，再用适当的溶剂洗脱。样品中各种成分通过柱子取决于与固相成分的相互作用，最后以不同速率被洗脱出来，达到将各个成分分离的目的。凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤、分子筛层析或排阻层析。单个凝胶珠本身象“筛子”。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。1.2凝胶过滤层析带网孔的葡聚糖珠小分子进入葡聚糖珠内大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出凝胶过滤层析过程示意图凝胶过滤层析过程示意图小分子

5、大分子凝胶基质凝胶珠蛋白质Mr=49,000洗出液中的蛋白质浓度洗脱体积（mL）未知logMr洗脱体积与相对分子质量的关系Andrews的经验公式：logMr=K1-K2(Ve/Vo)球蛋白Mr“选择性曲线”G-200G-100logMrKav如果被分离的样品中各个成分受溶液pH的影响，有时带正电荷，有时带负电荷，此时就可利用离子交换层析方法进行样品的分离。离子交换层析的固相是离子交换体，包括离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换葡聚糖。带有SO3－或COO－基团，通常以SO3－Na＋或COO－H＋形式出现的叫做阳离子交换基；带有N＋（C2H5）基团通

6、常以N＋（C2H5）Cl－出现的叫做阴离子交换基。3离子交换层析阳离子交换基强酸性，聚苯乙烯树脂弱酸性，羧甲基纤维素弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂阴离子交换基强碱性，聚苯乙烯树脂弱碱性，二乙氨乙基纤维素时刻要记住：蛋白质是由氨基酸聚合形成的聚合物，所以蛋白质也存在等电点（pI），蛋白质在溶液中带电状况同氨基酸相同，取决于所处溶液的pH值。当pIpH时，蛋白质带净正电荷。举一例子：已知蛋白X等电点为7，设计实验利用阴离子交换树脂纯化。答案：建立阴离子交换柱，比如Q-Sepharose。用pH8.5的缓冲液平衡柱子，同

7、时蛋白X溶解于pH8.5的缓冲液中，在此pH值下蛋白X带有负电，将含有蛋白X的混合液上样，然后用起始液冲洗，蛋白X会与此柱结合，然后盐梯度洗脱。阳离子交换层析过程离子交换树脂蛋白质高离子强度洗脱液洗高离子强度洗脱液洗加样平衡液洗收集依赖于蛋白质和它的配体（ligand）之间的相互作用来分离的。配体通常指的是能与另一个分子或原子结合（一般是非共价结合）的分子、基团、离子、或原子。但在亲和层析中，配体是通过共价键先与基质结合，配体可以是酶结合的一个反应物或产物，或是一种可以识别靶蛋白的抗体。当蛋白质混合物通过装有连接了配体的基质的亲和层析柱时，只有靶蛋白可

8、以特异地与基质结合，而其它没有结合的蛋白质首先被洗脱下来。特异结合在基质上的靶蛋白最后可以用含