捻转血矛线虫精氨酸激酶的克隆表达与其抗原特性分析

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1、万方数据摘要捻转血矛线虫精氨酸激酶的克隆表达及其抗原特性分析捻转血矛线虫属于圆线目(S仃ongylam)，毛圆科(Trichostrongylidae)，血矛属(Haemonchus)，主要寄生在反刍兽的第四胃，偶见于小肠，以吸食宿主动物的血液为生，导致宿主贫血和引发贫血综合症，严重的可致动物、特别是幼畜的大批量死亡，致使畜牧养殖业蒙受巨大损失。目前，主要靠化学药物控制捻转血矛线虫病，但是化学药物的滥用已导致捻转血矛线虫抗药虫株在世界范围内出现，不仅污染环境，而且残存化学药物的农畜产品流入市场也会严重影响人类的身体健康。因此寻找符合时代要求的新的防控捻转血矛线虫病方法已迫在眉睫。

2、当今，对捻转血矛线虫的免疫学研究已经取得重大进展，但仍无商品化的疫苗上市。因此发掘新的抗原及深入研究该虫体抗原的特性对捻转血矛线虫病的防控具有重要意义。本文对捻转血矛线虫的精氨酸激酶进行基因克隆、表达与纯化，并对重组蛋白的酶活性进行分析；研究了该重组蛋白对山羊外周单核细胞各细胞因子mRNA转录水平的影响及对外周血单核细胞的增殖作用；分析了精氨酸激酶在捻转血矛线虫雌、雄虫体内的分布情况。l捻转血矛线虫精氨酸激酶基因的克隆与表达根据捻转血矛线虫精氨酸激酶(ArginineKinase，AK)基因序列设计1对特异性引物，用RT-PCR方法从捻转血矛线虫总RNA中扩增出约为1104bp的

3、DNA片段。将该片段克隆到pMDl9一T载体后进行序列测定和分析，发现该基因与GenBank中捻转血矛线虫AK基因的相似度为99％。将该基因的开放阅读框克隆到pET-32a(+)载体中，获得原核表达质粒pET32／AK，并转化大肠杆菌BL21，重组子用IPTG诱导，经SDS．PAGE分析，结果发现该基因获得了表达，重组蛋白分子量大小约为60．3KD，重组蛋白主要以包涵体形式存在。对该包涵体蛋白变性、纯化后，用梯度尿素对其进行连续透析复性后，Westernblot分析显示该重组蛋白可被人工感染捻转血矛线虫山羊的血清所识别。2捻转血矛线虫精氨酸激酶的酶活性测定为了解捻转血矛线虫精氨酸

4、激酶的催化特性，进而为其成为有效药物靶标奠定基万方数据捻转血矛线虫精氨酸激酶的克隆表达及其抗原特性分析础。本实验采用改进的定磷法对原核表达的重组蛋白进行精氨酸激酶酶活性测定，选用10、20、25、30、35、40、50和60℃8个温度点和5．O、6．0、6．5、7．O、7．5、8．0、9．O和10．0共8个pH点进行酶的催化反应，分光光度计于660rim处测反应体系的吸光度，根据磷含量和酶活性定义计算其酶活性。结果发现，该重组蛋白具有一定的酶活性，其最佳反应温度和pH分别为30℃和pH7．5。3捻转血矛线虫重组AK蛋白对山羊外周单核细胞细胞因子表达情况的影响用0、10、20、40

5、“g／mL四种不同浓度的重组AK蛋白分别刺激山羊外周血单核细胞，37。C共培养24h后，收集培养细胞并提取其总RNA，采用荧光定量PCR技术检测各实验组中IL．2、IL．4、IL．10、IL．17、IFN吖和TGF—pmRNA转录水平。结果显示，在重组AK浓度为40pg／mL组中IL．17mRNA转录水平是对照组(空pET032a(+)蛋白组)的9．45倍，在20gg／mL组中其为对照组的2．69倍；IFN吖的mRNA转录水平在10、20、40I．tg／mL三个实验组中分别是对照组的2．20、3．15、4．14倍。而IL．2、IL．4、IL一10和TGF—D变化不显著。4捻转血矛

6、线虫重组AK蛋白对山羊外周单核细胞的增殖作用为检测捻转血矛线虫重组AK蛋白对山羊外周血单核细胞的刺激与增殖作用，将0、10、20、40gg／mL四个不同浓度的重组蛋白与山羊外周血单核细胞37。C共同培养24h后，用CCK．8试剂盒检测其增殖效果。结果发现重组AK在添加浓度为10l上g／mL和20gg／mL时增殖效果显著，其增殖指数分别为1．68和1．39；而pET-32a(+)空载体蛋白刺激增殖效果不显著，其增殖指数为0．95，这说明AK有促进山羊外周血单核细胞增殖的效果。5精氨酸激酶在捻转血矛线虫雌、雄成虫中的定位为研究捻转血矛线虫AK在捻转血矛线虫虫体中的分布以及定位情况，本

7、试验中应用Wistar大鼠制备抗血清，并应用即用型SABC免疫组化试剂盒检验精氨酸激酶在捻转血矛线虫雌、雄虫体内的分布。结果发现AK在雌雄虫体内的表达部位较广，除表皮等无细胞部位外，其他位置如皮下组织、肌肉及肠道等均有表达。关键词：捻转血矛线虫；精氨酸激酶；酶活性；细胞因子；细胞增殖；免疫组化万方数据ABS丁RACT1-_‘●一一一ArgininekanaseinHaemonchuscontortus：cloninl三．expression1·■■-●■●-‘annantigen