捻转血矛线虫hc38基因在毕赤酵母中的表达及生物学特性初探

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1、分类号：密级：公开学号：2010108056单位代码：10759石河子大学硕士学位论文捻转血矛线虫Hc38基因在毕赤酵母中的表达及生物学特性初探学位申请人张平王新华研究员指导教师薄新文研究员申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称预防兽医学研究方向动物传染病诊断与防治所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2013年6月ExpressionofHaemonchuscontortusHc38GeneinPichiapastorisandbiologicalcharacteristionpreliminaryexplorationADissertationS

2、ubmittedtoShiheziUniversityInFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByZhangping(PreventiveVeterinaryMedicine)DissertationSupervisor:Prof.WangXin-huaProf.BoXin-wenMay，2013使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许

3、被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日项目资助本研究由以下项目资助国家自然科学基金项目捻转血矛线虫基因Hc38吸血和免疫逃避的生物学种属特性研究（项目编号：30960281）捻转血矛线虫Hc38基因在毕赤酵母中的表达及生物学特性初探I捻转血矛线虫Hc38基因在毕赤酵母中的表达及生物学特性初探摘要Hc38基因位于捻转血矛线虫肠上皮微绒毛上，澳大利亚学者Hartman等(2001)在通过Northern杂交发现该基

4、因在肠上皮微绒毛内呈高丰度表达，进而推测其表达产物是一种与吸血和免疫逃避有关的功能蛋白，为防治捻转血矛线虫病提供可靠的方法。本论文取得的主要研究结果如下：采用PCR方法从Hc38全长质粒中扩增出保守结构域HcP，并构建真核表达载体pPIC9K-HcP,电转法将其转入毕赤酵母GS115中,采用G418抗性梯度法筛选得到多拷贝重组菌株，甲醇诱导表达,应用SDS-PAGE分析重组蛋白的表达情况,并将表达蛋白用免疫亲和层析柱纯化，将纯化后的表达产物对牛、羊、鸡、兔、鼠的红细胞进行凝集试验，检测其凝集活性；对天然宿主羊的IgG、血红蛋白在体外进行孵育，应用SD

5、S-PAGE检测降解情况。实验结果表明重组的GS115酵母菌株可表达分泌pHcP,其表达在96h达高峰,分泌量可达0.1mg/L，且纯化后的表达产物经Westernblot分析，能产生特异的免疫印迹条带，说明表达产物具有良好的反应原性。HcP表达产物对动物红细胞的凝集活性具有种属专一性；对天然宿主羊的IgG、血红蛋白都有降解作用，验证了前期对该基因功能的推测，即与该线虫的吸血和免疫逃避有关。说明本试验在毕赤酵母中成功表达了具有生物学活性的pHcP。关键词：捻转血矛线虫；HcP；毕赤酵母；真核表达I捻转血矛线虫Hc38基因在毕赤酵母中的表达及生物学特性

6、初探AbstractHc38geneintheintestinalepitheliummicrovilli,AustraliascholarHartman(2001)foundthatthisgenepresentahighexpressionintheintestinalepitheliummicrovillibyNorthernhybridize,toinferitsexpressionproductisakindofimportantfunctionoftheproteinabouthemophagiaandimmuneescape,andth

7、enprovidereliablymethodsforpreventionandcureHaemonchosis.Inthisstudy,wehaveobtainedthefollowingresults:TheporcineHcPgenewasamplifiedfromrecombinantplasmidHc38byPCR,thenthefusionexpressionvectorpPIC9K-HcPwasconstructedbyinsertingHcPfragment,andtransformedtoGS115byelectroporation

8、.Multi-copyrecombinantstrainswerescreenedbyG418.Theexp