《流式细胞技术》课件

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1、流式细胞技术与流式细胞仪flowcytometry&FlowCytometer(FCM)主要内容基本原理基本结构主要性能指标临床应用流式细胞仪的发展简史1934年Moldavan使悬浮的血红细胞从一个毛细玻璃管中流过，每个通过的细胞可被一个光电装置记录下来，这可谓流式细胞仪的最初模型。1947年，Gucker首次采用鞘流原理对气体中的微粒进行计数。1953年，Crosland-Taylor利用同一原理，成功的设计了一种鞘流系统，配合光电技术对红细胞进行计数。1969年VanDilla和LosAlamos采用了Cr

2、osland-Taylor设计的层流流动室和氩离子激光器开发出了液流束、照明光轴，检测系统三者互相垂直的流式细胞仪，成为目前各种流式细胞测量仪的基础。1972年，数位研究者在斯坦佛大学研制了一台荧光激活细胞分选仪，它标志着流式细胞仪商品化时代的真正到来。1974年，BD公司正式投产，商品名FACS-1TM.目前的主流生产商，美国的BD公司、Coulter公司。一、流式细胞仪的基本原理（一）流式细胞仪的分析原理单细胞液柱已标记的单细胞悬液和鞘液硅化管流动室喷嘴荧光检测系统和散射光感受系统收集光信号荧光染料被激发发光

3、光电倍增管脉冲信号计算机系统分析结果放大垂直相交形成稳态水平激光与之细胞组成细胞功能大小细胞表面/胞浆/核--特异性抗原粒度细胞活性DNA,RNA含量胞内细胞因子蛋白质含量激素结合位点钙离子,PH值,膜电位酶活性流式细胞仪常检测的细胞特性FCM的液流系统（如何形成单个细胞流）通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。（二）流式细胞仪的分选原理细胞悬液形成液流柱流动室振动液流断裂成液滴空白液滴含细胞的液滴弃去偏转落入收集器压电晶体产生机械振动不充电充电分选基本原理二、流式细胞

4、仪的基本结构流动室及液流驱动系统激发光源及光束成形系统光学系统信号检测和存储系统显示分析系统细胞分选系统（一）流动室是FCM的核心部件，由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央开一个孔径为的长方形孔，供单个细胞通过，检测区在该孔的中心或下方。流动室内充满了鞘流，其作用是将样品流环包。鞘流原理细胞悬液流过检测光束，约30%的细胞在流动中明显偏离轴心，有向流速较慢的区域聚焦的趋势。阻塞管路聚焦的细胞直接影响测量结果由于细胞偏离轴心造成其移动时间延长，降低检测速度。激光束无法对准照射在细胞中心鞘流原理流动的液体可分为稳流(层流

5、)和湍流两种状态层流原理：液体流动状态有一个分界点，即雷诺数其定义为：在一个直径为的管子内，液体的流速为v，密度为，黏滞系数为，当时，液流处于层流状态；当时，液流处于湍流状态。流式细胞仪中要求标本处于层流状态。常把流速限制在10m/s以下。鞘流原理由此发展的鞘流技术，实现两种液体的同轴流动，标本位于轴心稳定流动，外面包被有鞘液。鞘流处于湍流状态，围绕标本喷嘴高速流动，这样就使得标本流与鞘流形成稳定的同轴流动状态。由于标本喷嘴处于流动室的中心，就使得标本流在鞘流包被下，恒定处于同轴流动的中心位置，其精度可以稳定在几

6、个微米之内。标本流的位置的稳定可通过调整它与鞘液流速的比例来实现，一般比例在1:50到1：几百之间。鞘流原理Bernoulli定律：当液体流经截面不同的管道时，有，S和v分别是两个管道的截面积和液体的流速。鞘液流动方向LowerpressureTheBernoulliEffectVelocityGradient液流驱动系统（二）激光光源流式细胞仪的激发光源通常采用激光，通常用的激光包括氩离子激光（488nm）、He-Ne激光（633nm）和半导体激光（635nm)。由于细胞快速流动，通过光照区的时间只有1微秒左右

7、，且细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激光光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。(二)激光光源激光光源的宽度大于被测细胞，为零分辨率信号。狭缝扫描技术：（三）光学系统主要元件为滤光片，分长通滤光片、短通滤光片、带通滤光片。长波通双色性反射镜：大于特定波长的光通过而将小于特定波长的光反射光学系统示意图细胞通过激光照射区时，受激光激发，产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间360度立体角发射，产生散色光和荧光信号。（四）信号检测系统（四）信号检测系统散

8、射光检测前向光散射（FSC,ForwardScatter）侧向光散射（SSC,SideScatter）散射光不依赖任何细胞样品的制备技术(如染色)，因此被称为细胞的物理参数或称固有参数。以上两种信号都是来自激光的原光束，其波长与激光的波长相同。荧光检测(Fluoresencedetector)（1）前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方