流式细胞技术课件

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1、第15章流式细胞技术的原理和应用陈鲤翔副教授Email：lxchen@zzu.edu.cn流式细胞技术（Flowcytometry,FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速对单个细胞或其他生物微粒（如细菌）的理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。30年代：设想使细胞检测自动化50-60年代：分层鞘流原理、分光光度计定量细胞成

2、分及结合测量值对细胞分类，提出细胞分选70年代：单克隆抗体技术和荧光标记技术1973年：第一台商用流式细胞仪FACSI发展方向：荧光染料的开发、细胞的制备方法、提高电子信号的处理能力等流式细胞仪的发展史BD公司流式细胞仪FACSCaliburLSRIIFACSCantoFACSCountFACSVantageFACSAriaMoFloAstriosEQ超高速流式分选系统Gallios流式细胞仪Beckman公司流式细胞仪Navios流式细胞分析系统应用：细胞生物学，肿瘤学，血液学，免疫学，药理学，遗传学及临床检验学等细胞组成

3、细胞功能大小细胞表面/胞浆/核--特异性抗原粒度细胞活性DNA,RNA含量胞内细胞因子蛋白质含量激素结合位点钙离子,PH值,膜电位酶活性流式细胞仪常检测的细胞特性液流系统光学系统数据处理系统一、流式细胞技术原理1、流式细胞仪的基本结构：由样本和鞘液组成待测细胞单个细胞的悬液荧光染料标记的单抗对其染色受清洁气体压力从样品管进入流动室形成样本流鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。（1）液流系统FluorescenceSignalFocused

4、LaserBeamShealthFluid液流系统示意图InjectorTip样本管鞘液管激光光源：气冷式氩离子激光器分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长光束成形器：两十字交叉放置的透镜透镜组：形成平行光，除去室内光滤片：长通、短通、带通光电倍增管：FS,SS（散射光），FL1,FL2,FL3,FL4（荧光）（2）光学系统光学系统示意图散射光的测定细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为前向散射光和侧向散射光。光信号的测定前向散射光（fo

5、rwardscatter,FS）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°~10°)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。侧向散射光（sidescatter,SS）：激光束照射细胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。淋巴细胞单核细胞中性粒细胞光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群荧光信号由被检细胞上标

6、记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。线性放大器和对数放大器荧光测定荧光补偿FITCAPCPEPerCP/Cy5.5每一种荧光分子都发射某一特定波长范围内的光，然而这些荧光的发射光谱会发生重叠，有时这种重叠现象非常显著。荧光补偿是指修正荧光渗漏的过程，如从探测器除去除匹配荧光以外的任何荧光信号。荧光补偿PEFITCPE+

7、cellsFITC+cellsTodocolourcompensation:ForPureFITC+cells,=PEsignal-%FITCsignalForPurePE+cells,=FITCsignal-%PEsignalAftercompensationPEFITCPE+cellsFITC+cellsGOODcompensation:Y-meanoftheFITCcell=theY-meanof-/-cellsX-meanofthePEcell=theX-meanof-/-cellsPEFITCPE+cellsFIT

8、C+cellsOVERcompensation细胞悬液形成液流柱流动室振动液流断裂成液滴空白液滴含细胞的液滴弃去偏转落入收集器压电晶体产生机械振动不充电充电细胞分选分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分率。分选收获率：实