流式细胞技术与应用ppt课件.ppt

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1、流式细胞技术及其在科研中的应用哈尔滨医科大学附属二院检验科刘彦虹课程内容第一部分概要第二部分仪器构造及工作原理第三部分技术及方法第四部分应用第一部分概要§1.1基本概念流式细胞技术（FlowCytometry,FCM）是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析和分选的技术。(荧光显微镜技术的改良)流式细胞仪（FlowCytometor,FCM）是一项集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的检测仪器。又称(Fluorecenceactivatedcellsorter,FAC

2、S)FACSortFACSCaliburFACSVantage§1.2技术特点单细胞分析：任何单细胞悬液，如血液、骨髓、体液中的细胞、培养细胞，实体组织经处理后制成单细胞悬液。快速分析：极短时间内可分析大量细胞，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞仪可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。§1.2技术特点多参数分析：可同时分析单个细胞的多种特征,当同时用多种分子探针,如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色,通过流式细胞分析,即可获得单细胞的多种信息,使细胞亚群的识别、计数等更为准确。定性或定

3、量分析：通过荧光染色对单细胞的某些成分如DNA含量、抗原或受体表达量、Ca2+浓度等均可进行单细胞水平的定性与定量分析。第二部分仪器构造及工作原理§2.1仪器构造1.流动室及液流驱动系统2.激光光源及光束形成系统3.光学系统4.信号检测与存贮、显示、分析系统5.细胞分选系统§2.2工作原理1.流动室仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。流动室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央开一个孔径为430×180um长方形孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心。流动室内充满鞘液，鞘液的作用是将样品流环包，使样品流不会脱离液流的轴线方向，并且保证每个细胞通过激光照射

4、区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。液流驱动系统将待测细胞或微粒进行荧光染色后制成悬液标本，在一定气体压力下将待测样品压入流动室，用不含细胞或微粒的缓冲液（又称鞘液）在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测细胞或微粒流成一定角度，使鞘液包绕着细胞或微粒高速流动，形成一个圆形的流速（即鞘流），待测细胞在鞘液的包裹下单行排列，依次通过流式细胞仪的检测区域。§2.2工作原理§2.2工作原理2.激光光源目前FCM大多采用氩离子气体激光器，波长为488nm。激光是一种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源。用

5、聚焦透镜对激光光束聚焦后，可以在照射区得到一个近似扁平的椭圆形光斑，其厚度可达20μm。当流动的细胞经过光斑时才能被激光照射并产生光散射和发射荧光。§2.2工作原理3.光学系统FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它们分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器。§2.2工作原理4.信号检测（1）散射光信号前向角散射(ForwardScatter,FSC)侧向角散射(SideScatter,SSC)（2）荧光信号前向角散射光（FSC）激光器激光器激光探测器大颗粒小颗粒侧向角散射光（SSC）激光器侧向散射光探测器§2.2工作原理5.数据的

6、存贮、显示与分析FCM数据存贮的方式均采用列表排队方式。数据的显示通常有一维直方图、二维点图等。§2.2工作原理单参数直方图二维散点图§2.3细胞分选原理当细胞悬液形成液流柱经流动室，流动室上方的压电晶体产生机械振动带动流动室以相同频率进行振动，使液流注断裂成一连串均匀的液滴，仅少量液滴含有细胞，有大量不含细胞的空白液滴。当实验设计中设定了被分选的细胞的特性参数时，此类细胞在形成液滴时会被充电，使其带有正电荷或负电荷，未被设定分选参数的细胞及空白液滴不带电荷。带电荷的液滴在落入电极偏转板的高压静电场，依所带电荷是正或是负而发生向右或向左的偏转，落入指

7、定的收集器中，完成细胞分选的目的。第三部分技术要点§3.1荧光探针的选择1.根据仪器类型选择荧光探针FACSort配有488nm单激光器。FACSCalibur配有488nm和633nm双激光器。2.根据荧光强度大小选择荧光探针各种荧光色素有不同的发射荧光强度。在多色免疫荧光分析中，应选择荧光强度最强的荧光色素标记的单克隆抗体，尤其是对于表达量较低抗原的分析更是如此。常用荧光染料的特性荧光染料分子量激发波长(nm)发射波长(nm)颜色用途FITC390488525深蓝免疫荧光PE240000488575橙色免疫荧光PerCP35000488677红色

8、免疫荧光PeCy5224000488670红色免疫荧光PeCy7224000488755深红色免疫荧光PI4