实用高效液相色谱法的建立-破解版

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1、1液相色谱方法开发（实例讲解）色谱分离与在线检测技术已经成为当今分析化学的一门重要学科，而因其衍生出的相关产品也日益丰富。对色谱工作者来说，在面对具体方法开发中如何获得适当的分离度则成为关注的焦点。本文仅从网络上的资源收集简要介绍反相液相色谱法的建立思路。一一、一、基本术语读者可跳过本部分内容，直接阅读实例讲解部分在评价色谱分离的品质时，通常用以下相关术语来反映色谱特征（如图1.）：图1.典型色谱图1.保留因子(k)：tR−t0k=(1)t0用于反映化合物的色谱保留性质，跟化合物性质有密切关系。如图1，设tR1=3.65min,t0=1.20min,则峰1的保

2、留因子为：(3.65-1.20)/1.20=2.042.拖尾因子(Tf)2010©未经许可，不得复制。转载请注明出处。如有问题请联系：ybsmart2004@163.com2液相色谱方法开发（实例讲解）Wa+WbTf=(2)2Wa图2.典型拖尾峰在理想情况下，色谱峰为高斯型对称峰，其拖尾因子为1.0，但在实际情况中，由于化合物的二次保留等其他因素，色谱峰大多会呈现一定程度的拖尾。如图2中，该色谱峰的拖尾因子可计算得：{(41.5-37.0)+(37.0-35.0)}/{2*(37.0-35.0)}=1.63.3.理论塔板数（N）2010©未经许可，不得复制。转

3、载请注明出处。如有问题请联系：ybsmart2004@163.com3液相色谱方法开发（实例讲解）图3.峰高与峰宽的关系tRN=16()^2(3)W或tRN=.554()^2(4)W5.0注意：在上式中W为图3中的Wb，为基线峰宽(4σ)，W0.5为峰高一半处的峰宽Wh(2.335σ),并非峰宽的一半(2σ)。设图1中峰1的基线峰宽为0.25min,则塔板数为：16*(3.65/0.25)^2=34104.分离因子(α)k2tR2−t0α==(5)k1tR1−t0又称两个色谱峰的相对保留值。只有当α>1时，两个色谱峰才有分离的可能性。设在图1中峰2的保留时间为

4、6.50min,则分离因子为:(6.50-1.20)/(3.65-1.20)=2.162010©未经许可，不得复制。转载请注明出处。如有问题请联系：ybsmart2004@163.com4液相色谱方法开发（实例讲解）5.分离度(Rs)tR2−tR1Rs=2(6)W2+W1分离度用于评价色谱分离的品质，通常当Rs>1.5时，则认为两峰达到基线分离（完全分离）。设在图1中峰2的基线峰宽为0.45min，则峰1与2的分离度为：2*(6.50-3.65)/(0.25+0.45)=8.1上式为分离度的定义公式，用于精确计算两个色谱峰的分离度，而由此可推出如下为色谱工作者

5、的经验公式：kRs≈N4/(*α−*)1(7)k+1该式为经验公式，其目的在于描述分离度与理论塔板数、分离因子和保留值三者之间的关系，多用于指导色谱分离方法的建立，而不用于具体计算。二二、二、、分析方法的建立、分析方法的建立（（实例讲解（实例讲解）））简要介绍了色谱的基本术语，下面用实例来介绍分析方法的建立过程。1.1.1.准备工作在进行方法开发的时候，应记住良好的方法要具有以下三个要素：
能提供适当的分离度（通常要求Rs>1.5）
方法运行时间要适中，以利于日常分析
方法应具有稳定性，可以在不同实验室之间移植在进行方法开发之前，应该对所分析样品和仪器设备进行

6、信息剖析：样品的来源（单一化合物，生物样品，提取物等）及是否前处理；样品的溶解度；所分析化合物的结构（是否有官能团，发色基团等）及酸碱性；化合物的分子量（常规小分子，M<1000；生物大分子及聚合物，1000

7、有明显的紫外吸收。在了解以上信息后，并综合文献，选择了Eclipse(Agilent)C18色谱柱,规格4.6×150mm,填料粒径5µm。液相色谱仪为Agilent1200型，配置Chemstation工作站，VWD检测器，2010©未经许可，不得复制。转载请注明出处。如有问题请联系：ybsmart2004@163.com5液相色谱方法开发（实例讲解）四元低压梯度泵，柱温箱和自动进样器。流动相选用乙腈-水系统。样品直接用甲醇稀释定容。通常在方法开发之前建议先运行一个全范围的线性梯度洗脱（如0-100%乙腈），它会给后续是否采用等度洗脱还是梯度洗脱提供非常重要

8、的信息。在本例中，首先运行一个梯度持续