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时间:2019-06-19
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1、实验九肝脏中转氨酶活力的测定一、实验目的1.了解转氨酶的性质和临床意义;2.掌握谷丙转氨酶活力的测定方法二、实验原理本实验以丙氨酸的氧化脱氨基为例,分别测定谷丙转氨酶,谷氨酸脱氢酶活性外,又通过抑制剂观察肝组织中的联合脱氨基作用。在谷丙转氨酶的催化下,丙氨酸和α-酮戊二酸作用生成丙酮酸和谷氨酸。次反应可逆,平衡点近于1.0无论正向反应或逆向反应皆可用于测定此酶的活性,既可测定所产生的氨基酸,也可以测定生成的酮酸,因此可有多种测定方法。本实验以丙氨酸和α-酮戊二酸作为谷丙转氨酶作用的底物,利用内源性磷酸吡哆醛作为辅酶,在一定条件及时间作用后测定所生成的丙酮酸的量来确定其酶活力。丙酮酸能与2,4-
2、二硝基苯肼结合,生成丙酮酸2,4-二硝基苯腙,后者在碱性溶液中呈现棕色,其吸收峰为439-530nm,可用于测定丙酮酸的含量。α-酮戊二酸也能与2,4-二硝基苯肼结合,生成相应的苯腙,但后者在碱性溶液中吸收光谱与丙酮酸二硝基苯腙有差别,在520nm波长比色时,α-酮戊二酸二硝基苯腙的吸光度远较丙酮酸二硝基苯腙为低(约相差3倍)。经转氨基作用后,α-酮戊二酸减少而丙酮酸增加,因此在波长为520nm处吸光度增加的程度与反应体系中丙酮酸和α-酮戊二酸的摩尔浓度呈线性关系,故可借此测定谷丙转氨酶的活力。三、实验材料、试剂和仪器(一)材料与试剂猪肝脏、乙醇、0.4mol/LNaOH标准丙酮酸溶液(1mL
3、相当于500μg):准确称取纯化的丙酮酸钠62.5mg,溶于100mL的0.05mol/L的H2SO4中,此液需临用前配制。谷丙转氨酶底物:称取L-丙氨酸0.90g及α-酮戊二酸29.2mg,先溶于pH7.4的0.1mol/L磷酸缓冲液中,然后用1mol/LNaOH调至pH7.4,再加pH7.4的0.1mol/L磷酸缓冲稀释至100mL,贮藏于冰箱内,可保存一周。(试验了一下pH接近7.5,中间未调整pH值)0.1mol/L的磷酸缓冲液(pH7.4):称取13.97gK2HPO4(如果是K2HPO4·∙H2O,则需称取18.31g)和2.69gKH2PO4溶于1000mL蒸馏水中。0.02%2
4、,4-二硝基苯肼溶液:称取2,4-二硝基苯肼20mg溶于少量1mol/L盐酸中,加热溶解后,利用1mol/L盐酸稀释至100mL。(二)仪器/器具电子天平、分光光度计、剪刀、移液管、组织破碎机四、实验步骤1.肝匀浆制备与稀释将猪肝用生理盐水冲洗,滤纸吸干,称取肝脏0.5g,剪成小块,置于烧杯内,加入4.5mL预冷的pH7.4的0.1mol/L磷酸缓冲液,制成10%肝匀浆,冰冻保存备用。吸取上述肝匀浆1mL,加入预冷的pH7.4的0.1mol/L磷酸缓冲液49mL(即稀释50倍)摇匀,作为实验中使用的稀释肝匀浆(室温中放置时间过久,会引起酶活性下降或失活因此需现用现配制,且放置时间不宜过久)。2
5、.谷丙转氨酶活力的测定(1)取试管4支,分别标“测定管A”、“对照管B”、“标准管S”,“空白管”按下表进行操作。测定管A标准管S对照管B空白管O谷丙转氨酶底物/mL0.50.50037℃保温5min稀释肝匀浆/mL0.1标准丙酮酸0.10.1H2O0.1混匀后,37℃水浴准确保温30min0.02%2,4-二硝基苯肼0.50.50.50.5谷丙转氨酶底物/mL000.50.5混匀后,37℃水浴准确保温20min0.4mol/LNaOH5.05.05.05.0(2)混匀后,静置10min,于520nm波长处进行比色,以空白管调零,读取测定管A、对照管B、标准管S的吸光度,将测定管A吸光度减去对
6、照管B吸光度后与标准管S相比算出其相当之丙酮酸含量。(3)谷丙转氨酶活力计算:本法规定酶在37℃与底物作用30min后,能产生2.5μg的丙酮酸的酶量为一个谷丙转氨酶活力单位(U)。五、实验结果测定管A标准管S对照管B空白管O520nm吸光值0.1020.1700.0320.0001.每毫升稀释肝匀浆谷丙转氨酶活力单位:=82.353其中,D——每毫升稀释肝匀浆谷丙转氨酶活力单位(U/mL),即肝匀浆的比活;A——样品管的吸光度值;B——对照管的吸光度值;S——标准管的吸光度值;500——标准丙酮酸溶液的浓度;2.5——谷丙转氨酶换算单位系数。2.每克肝脏谷丙氨酶的活力单位=20588.235
7、六、实验分析1、实验中的猪肝匀浆液要放置冰柜,室温放置太久酶活性会降低,会影响酶的测定。2、溶液量取过程中产生很多误差。3、保温完后下一步骤衔接不够紧凑,时间间隔导致温度稍有下降,造成酶活性降低。
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