谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定

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1、谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定一、实验目的1•用纸层折法观察肝脏丙转氨酶ALT的转氨作用2•用分光光度法测定血清丙转氨酶的活力3•学习治疗检测SGPT的方法及原理4•了解检测肝损伤模型的制备及SGPT在科研中的应用。二、仪器与试剂1实验材料动物肝脏2实验试剂10.9NaCl溶液2海砂31谷氨酸溶液1KOH溶液中和41丙酮酸钠溶液用1KOH溶液屮和50.1KHCO3溶液60.025一混乙酸溶液用1KOH中和72乙酸溶液8酚的饱和水溶液将2份酚和2份水按重量计算混合放入分液漏斗中振荡。静止24h以后分层将下部酚层放入瓶中备用。新配制的酚展

2、层剂可以反复使用1周。90.1水合苗三酮的正丁醇溶液100.1标准谷氨酸溶液110.1标准丙氨酸溶液121KOH溶液谷丙转氨酶活性的鉴定纸层析法一、实验原理观察肌肉糜中谷丙转氨酶所催化的氨基移换反应。通过纸层析法检查底物谷氨酸的减少和产物丙氨酸的生成。为防止丙酮酸被肌肉糜中的其它酶所氧化或还原在反应系统中加入了抑制剂漠乙酸。二、实验操作1•谷丙转氨酶提取液制备2g肝脏0.9NaCL6mL海砂200mg在低温下研磨成浆用稀薄的脱脂棉过滤得提取液滤液不清。2•转氨作用取试管2支按下表加入试剂加入试剂的单位为mL试剂对照管测试管1谷氨酸0.500

3、.501丙酮酸钠0.500.500.1KHCO30.500.500.025—漠乙酸可不加0.250.25煮沸的酶液0.50—酶液一0.50加脱脂棉塞45°C水浴1.5h时时振荡内容物2乙酸6滴6滴沸水浴2min使蛋白质完全沉下过滤作层析3•纸层析操作方法取圆形层析滤纸1张在圆心处用圆规绘出直径为3cm的同心圆滤纸不可以折通过中心将滤纸绘成四等分扇形。用毛细管点样2-4次直径不超过2mm在滤纸的圆心上剪一小孔直径约l-2mm取一小滤纸条将下端剪成刷状在卷成灯芯插入圆形小孔不能使灯芯突出纸面将圆形滤纸平放在盛有层析液水饱和酚培养皿上使灯芯向下与

4、溶剂接触用大小相同的培养皿盖在滤纸上溶剂通过灯芯上升到滤纸上向四周展层直到溶剂前沿移至距滤纸边缘约lcm处时停止展层时间为lh80-100°C烘箱干燥喷洒水合苗三酮的正丁醇溶液80-100°C显色。三、实验结果实验血清谷丙转氨酶活力单位测定一、实验原理本实验用丙氨酸和a-酮戊二酸为底物经转氨作用生成谷氨酸和丙酮酸。丙酮酸与24-二硝基苯腓作用生成24-二硝基苯腺此物质碱性条件下呈棕红色其颜色的深浅与丙酮酸的含量成正比可用比色法进行定量测定。通过与标准溶液的比较即可计算出酶的活力单位。二、实验试剂ll/15mol/LpH7.4的磷酸缓冲液取1

5、/15mol/L磷酸氢二钠称取Na2HPO49.47g或Na2HPO412H2O23.87g溶于蒸馆水中定容至1000mL825mLl/15mol/L磷酸二氢钾称取KH2PO49.078g溶于蒸馅水中定容1000mL175mL混合。2GPT基质液称*酮戊一酸29.2mg2

6、imol/L及a-DL■丙氨酸1.78g200pimol/L溶于50mLpH7.4的磷酸缓冲液中加O.lmol/LNaOH溶液0.5mL调pH为7.4然后加磷酸缓冲液定溶至100mL加少许氯仿防腐置冰箱屮可保存一周。3lmmol/L24-二硝基苯腓溶液称取24-二硝基苯月

7、井20mg溶解于10mL浓盐酸中以蒸馆水定容至1OOmLo42

8、imol/mL丙酮酸钠标准液精确称取丙酮酸钠22mg加磷酸缓冲液溶解后定容至100mL。临用前配制。50.4mol/LNaOH溶液三、实验操作一标准曲线的绘制试管试剂测定管空白管123452

9、irnol/mL丙酮酸钠标准液mL—0.050.100.150.200.25GPT基质液mL0.500.450.400.350.300.25pH7.4磷酸缓冲液mL0.100.100.100.100.100.10充分摇匀后置于37°C水浴保温lOmin24-二硝基苯聊溶液mL0.500.5

10、00.500.500.500.50充分摇匀后置于37°C水浴保温20min0.4mol/LNaOHmL5.005.005.005.005.005.00充分摇匀后室温静置30min后520nm波长下比色A520nm值相当丙酮酸含量ymol—0.100.200.300.400.50相当GPT单位lOOrnL—100200300400500以酶的活力单位数为横坐标以光吸收值为纵坐标绘制A520nm一与对应的酶活力单位数的标准曲线。1丙酮酸钠标准液mL数x摩尔浓度2)imol/mLo2GPT活力单位为每mL血清在37°C与pH7.4的基质液作用60

11、min生成lpmol丙酮酸为一个单位U。本实验临床检验取血清量为0.1mL报告数据以lOOmL血清计算因此将实际测得结果X1000即可。二酶活力的测定试管试剂对照管测定管01GP