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1、第10章基因工程基础第一节基因工程概述第二节目的基因的获得第三节分子克隆中常用的载体第四节分子克隆中常用的工具酶第五节目的基因和载体连接、转化、筛选第六节基因工程和医药烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversityDNA克隆克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合.获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning),即无性繁殖.技术水平:DNA克隆:分子克隆(molecularclone)细胞克隆个体克隆(动物或植物)第一节基因工程概述烟台大学药学院SchoolPh
2、armacyofYantaiUniversityDNA克隆:应用酶学的方法,在体外将各种来源的DNA(同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的)与载体DNA接合成一具有自我复制能力的分子——复制子(replicon),继而通过转化或转染宿主细胞,筛选出含有目的基因的转化子,再进行扩增提取获得大量同一DNA分子,也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA).烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversity生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等基因
3、工程(geneticengineering):实现基因克隆所用的方法及相关的工作,又称重组DNA工艺学.目的①分离获得某一感兴趣的基因或DNA②获得感兴趣基因的表达产物(蛋白质)烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversity分切转筛表接烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversity第二节目的基因的获得一目的基因的获得:化学合成聚合酶链式反应(PCR)方法扩增建立基因组DNA文库构建cDNA文库烟台大学药学院SchoolPharmacyofYan
4、taiUniversity化学合成法:要求:1)已知目的基因的序列或其产物的氨基酸序列2)片段不宜太长工具:自动化DNA合成仪应用:1)合成PCR引物2)寡核苷酸探针3)人工接头序列及较小的基因烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversity*化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversity聚合酶链式反应(PCR)方法扩增1985年美国科学家Mullis发明了聚合酶链式反应(Polymera
5、seChainReaction,PCR)技术PCR是应用最广的分子生物学技术之一,可用来快速在体外扩增DNA,PCR技术在临床检验和分子生物学中的应用十分广泛.PCR技术就是在体外的离心管中通过酶促反应有选择地大量扩增(包括分离)一段目的基因的技术,即体外进行DNA复制.烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversity需要的物质:模板DNA,引物,dNTP(Mg2+),TaqDNA聚合酶4种反应混合物经历变性、退火、延伸三步94℃,热变性,双链解开55℃,冷却退火,引物与模板的
6、单链DNA的特定互补部位相配对和结合72℃,TaqDNA聚合酶作用下,新链延伸,形成互补DNA双链如此30个循环可获得230个基因片段烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversity聚合酶链反应原理烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversityTaqDNA聚合酶(TaqDNApol,Taqpol)1969年在美国黄石公园温泉分离出一种嗜热真菌,cetus公司首次分离纯化了该酶,分子量94KD,该酶特点:最适反应温度是75℃-80℃,能抵抗链分离所
7、需要的高温(94℃-95℃)的反复处理.烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversity烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversity烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversity建立基因组DNA文库基因组DNA文库:分离供体细胞中的染色体DNA,酶切后,将这些染色体DNA片段与某种载体相接,而后转入大肠杆菌,建立包含有供体染色体DNA片段的克隆株,特点:克隆株群体提供全套遗传信息,即完整的基因组DNA烟台大学药学
8、院SchoolPharmacyofYantaiUniversity烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversity构建基因组文库过程:⑴分离纯化基因组DNA⑵制备全部基因组的DNA片段①机械断裂法(超声波或高速搅拌)断裂片段两端没有与克隆载体匹配的粘末端,因此插入载体之前还需要进行修饰加工,少用②限制性内切酶降解(鸟枪法)(常用Sau3A)断裂片段两端有与克隆载体匹配的粘末端,可以直
