《基因工程》ppt课件

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1、第七章基因工程(geneengineering)1重组DNA医药产品产品功能组织胞浆素原激活剂抗凝血液因子VIII促进凝血颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成促红细胞生成素剌激白细胞生成生长因子(bFGF,EGF)刺激细胞生长与分化生长素治疗侏儒症胰岛素治疗糖尿病干扰素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶抗组织损伤单克隆抗体诊断试验、肿瘤导向治疗乙肝疫苗(CHO,酵母)预防乙肝口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱2第一节重组DNA技术的原理重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后

2、转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作过程。也称为分子克隆技术,基因克隆或基因工程供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元素。3基因工程的操作过程酶切连接转化扩增检测目的基因的获取克隆载体的构建外源基因与载体的连接（体外重组）重组DNA导入受体菌转化子的筛选和鉴定克隆基因的表达4目的基因的克隆：基因工程或DNA重组技术的前提条件是从生物体中分离克隆目的基因。一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重

3、组克隆；另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。5第二节核酸的提取及检测就基因工程而言，核酸分子是其研究所涉及的主要对象，所以核酸的分离与提取是研究中很重要的基本技术。核酸样品的质量将直接关系到实验的成败。61.基因组DNA的分离与纯化DNA主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA），质粒DNA。总的原则:保证一级结构的完整性;排除其它分子的污染;7一般步骤:(1)破碎细胞，裂解细胞壁机械方法:超声波处理、研磨、匀浆化学方法:SDS（阴离子去垢剂）EDTA，使得DNase失活(

4、why?)酶学方法:溶菌酶或蜗牛酶(2)通过蛋白质变性或分解，使DNA游离出来(3)分离DNA82.cDNA的分离与纯化（1）总RNA的提取RNase，不需辅助因子，耐酸碱，分布极广RNase的来源外源：操作者，实验器皿，试剂，空气内源：不同组织和细胞数量不同创造无RNase的环境—DEPC(焦碳酸二乙酯)（配成0.1%的DEPC水）—异硫氰酸胍Trizol试剂9逆转录过程中cDNA的合成依赖RNA的DNA聚合酶核糖核酸酶H活力依赖DNA的DNA聚合酶10Trizol试剂Trizol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地

5、变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。11※0.1%的8-羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。※异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。※β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。12Trizol法提取总RNA的实验原理：Trizol试剂裂解细胞并释放出RNA,酸性条件使RNA与DNA分离,加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收

6、集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。13（2）第一链的合成14（3）第二链的合成cDNA第二链的合成方法——自身引导法15自身引导合成法较难控制反应，而且用S1核酸酶切割发夹结构时无一例外地将导致对应于mRNA5’端序列出现缺失和重排，因而该方法目前很少使用。16cDNA第二链的合成方法－置换合成法利用第一链在反转录酶作用下产生的cDNA:mRNA杂交链，不用碱变性（水解mRNA），而是在dNTPs存在下，利用RNA酶H在杂交链的mRNA

7、链上造成切口和缺口。从而产生一系列RNA引物，使之成为合成第二链的引物，在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成第二链。17cDNA第二链的合成方法－置换合成法DNApoldNTPsRNaesH5‘ppp’5GGAAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’AAAAAAAAAAAAAAp5’5’S1AAAATTTOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’5’TTTTTTTTTTTTTTOH3’AAAAAAAAAAAAAA5’5’TTTTTTTTTTTTTT3’3’T4-D