《凝胶电泳》PPT课件

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1、第二节基因操作的主要技术原理凝胶电泳扩增原理分子杂交DNA测序生物芯片一、凝胶电泳它是一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，同时也是分子生物学研究方法的技术基础。琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳脉冲电场凝胶电泳1、基本原理带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链，依靠无反应活性的稳定的介质（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，在电场中以一定的迁移率从负极移向正极。根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。DNA的迁移速率决定因素1DNA分子的大

2、小双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比；2琼脂糖浓度浓度越低，相同核酸分子迁移越快；3DNA的构象一般同一分子：超螺旋环状＞线状＞切口环状。4凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。5所用的电压低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比。6琼脂糖种类常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖；凝胶电泳的分辨力：与凝胶的类型和密度相关琼脂糖凝胶的分辨力在0.2～50Kb之间;聚丙烯酰胺的分辨力在1～1000bp之间SeparationRangeVs.%Agaro

3、seLowGelingAgarose4-60.02-0.4不同类型琼脂糖的性质琼脂糖类型凝结温度/℃熔化温度/℃标准琼脂糖35~3890~95不同厂家生产的不同商品其凝结温度和熔化温度有一定差异40~4285~90高强度琼脂糖34~4385~95修饰的低熔点/凝点琼脂糖25~3563~653565超低熔点8~1540~45低黏性低熔点琼脂糖25~307038853075AgaroseGelElectrophoresis琼脂糖（agarose）是一种从红色海藻中提取出的线性多糖聚合物。半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷2、

4、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。D-半乳糖3，6-脱水-L-半乳糖琼脂糖凝胶的特点（一）优点1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。3.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒等大分子物质。4.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定6.有热可逆性（二）缺点1.机械强度差，易破碎，浓度不能太低。2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制。3.琼脂糖支持层

5、上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。4.与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。分为常熔点的琼脂糖和低熔点（LMP）琼脂糖。（1）LMP琼脂糖熔点：62～65℃熔解后，在37℃可保持液态数小时；在25℃可保持液态约10min回收DNA操作：将凝胶在65℃下加热数分钟，再向液态琼脂糖中加入过量酚液抽提DNA，经离心获得含DNA分子的上清液，酶切DNA片段后电泳。（2）琼脂糖凝胶电泳的参数：缓冲液：1×TAE（TBETPE）凝胶的含量：根据检测的DNA大小加DNA样品：<1μg，指示剂溴酚蓝电泳条件：大片断低电压长时间，小片段

6、高电压短时间(5V/cm)（2）琼脂糖凝胶电泳的参数：染色和观察：溴化乙锭（ethidiumbromide，EB）染色，在300nm波长的紫外下观察（凝胶成像仪），能看到0.05μg的微量DNADNA的片断大小与荧光强度成正比操作预染色的标本用已知分子量的标准DNA对DNA片断大小的估算SampleWell25ng1kbladder0.8%Agarose124681012kbAgaroseGelElectrophoresisEtBrDetectionLimit:~5-10ngDNAAgarosegelelectrophores

7、isAgarosegelelectrophoresis【注意事项】1.琼脂糖融化时，档位不宜太高。2.制胶和加样过程中要防止气泡的产生。3.EB具有强诱变性，可致癌。必须戴手套操作，严格注意防护。4.加样时，Tip头不宜插入样品孔太深，也不要穿破胶孔壁，否则样品渗漏或DNA带型不整齐。5.电源接通时，应核实凝胶的方向是否正确。6.电泳仪有电压显示，并不一定标志电泳槽已接通，应观察电极气泡出现情况。负极的气泡比正极多一倍，表示电泳已开始。7.溴化乙锭可插入到DNA分子的双链中，在紫外光的照射下，插入溴化乙锭的DNA呈橙红色荧光，

8、所以溴化乙锭可以作为荧光指示剂指示DNA含量和位置。3、聚丙烯酰胺凝胶电泳PolyacrylamideGelElectrophoresis，PAGE-原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N,N-methylen