《核酸的凝胶电泳》PPT课件

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1、第四节核酸的凝胶电泳NucleicAcidGelElectrophoresisContentofTable前言一、琼脂糖凝胶电泳二、聚丙烯酰胺凝胶电泳三、脉冲场凝胶电泳前言核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段；优点：（1）便于分离;（2）便于检测;（3）便于回收：核酸凝胶电泳的基本原理1）核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈负离子化状态；核酸分子在一定的电场强度的电场中，它们会向正电极方向迁移；2）由于在电泳中往往使用无反应活性的稳定的支持介质，电泳迁移率（或迁移速度）

2、与分子的摩擦系数成反比。而摩擦系数是分子大小、介质粘度等的函数；因此，可在同一凝胶中、一定电肠强度下、可在凝胶上分离出不同分子量大小或相同分子量但构型有差异的核酸分子。Home一、琼脂糖凝胶电泳Agarosegelelectrophoresis（一）凝胶的制备及电泳（二）DNA的迁移速率决定因素1DNA分子的大小双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比；2琼脂糖浓度浓度越低，相同核酸分子迁移越快；3DNA的构象一般同一分子：超螺旋环状＞线状＞切口环状。4凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭溴化乙锭（E

3、B）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。5所用的电压低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比。6琼脂糖种类常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖；不同类型琼脂糖的性质琼脂糖类型凝结温度/℃熔化温度/℃标准琼脂糖35~3890~95不同厂家生产的不同商品其凝结温度和熔化温度有一定差异40~4285~90高强度琼脂糖34~4385~95修饰的低熔点/凝点琼脂糖25~3563~653565超低熔点8~1540~45低黏性低熔点琼脂糖25~307038853075不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围浓度（

4、%）标准(kb)高强度(kb)低熔点(kb)低黏度低溶点(kb)0.31~500.50.7~250.80.5~150.8~100.8~101.00.25~120.4~80.4~81.20.15~60.3~70.3~71.50.08~40.2~40.2~42.00.1~30.1~33.00.05~10.5~14.00.1~0.56.00.01~0.17电泳缓冲液常用的有TAE、TPE及TBETAE、TPE及TBE电泳缓冲液比较都是常用电泳缓冲液。三者相比：1）TAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶

5、的阳极一侧将发生酸性化；2）TBE和TPE比TAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量；3）双链线状DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中迁移快10%；4）对于高分子质量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE或TPE，对于低分子质量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的电泳分辨率要好于TBE。（二）凝胶载样缓冲液载样缓冲液：临上样到凝胶加样孔之前与待电泳的样品相混合的一种缓冲液。载样缓冲液有三个作用：1）增加样品密度保证DNA沉入加样孔内；2）使样品带有颜色便于简化上样过程；3）其中的染料在电场中以可以预

6、测的泳动速率向阳极迁移。6×凝胶载样缓冲液类型6×缓冲液贮存温度I0.25%溴酚蓝4℃0.25%二甲苯氰FF40%(m/V)蔗糖水溶液II0.25%溴酚蓝室温0.25%二甲苯氰FF15%Ficoll(Type400)水溶液III0.25%溴酚蓝4℃0.25%二甲苯氰FF30%甘油水溶液IV0.25%溴酚蓝4℃40%(m/V)蔗糖水溶液（三）琼脂糖凝胶中DNA的检测通过染色,紫外灯下检测。主要有溴化乙锭（ethidiumbromide,EB）染色法和SYBRGold染色法。1凝胶的EB染色使用EB染色注意事项（

7、1）EB被认为是一种强致癌物质（2）EB可用来检测单链或双链核酸（3）EB使用时的配制、贮存及使用EB常用水配制成10mg/ml的贮存液，于室温保存在棕色瓶或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为0.5μg/ml。（4）当要知道DNA片段准确大小时，凝胶应在无EB情况下电泳，电泳结束后再用EB染色。2凝胶SYBRGold的染色SYBRGold是一种新型极敏感染料的商品名称。其与DNA结合的亲和力高，并且结合后，能够极大增强荧光信号。（四）凝胶中DNA的成像可以用透射或入射紫外光对EB染色的凝胶成像，图像可以直接输出到

8、计算机观察。（五）凝胶中DNA的回收现一般采用试剂盒回收：存在的主要问题：1不能有效的回收大片段DNA2不能有效回收少量DNAHome二、聚丙烯酰胺凝胶电泳polyacrylamidegelelectrophoresisPAGE在TEMED(四甲基乙二胺)催化过硫酸铵还原产生的自由基的存在下，丙烯酰胺单体的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的线状长链。在双功能交联剂如N，N`-亚甲双丙烯酰胺的参与下的共聚合反