《细胞凝胶电泳》PPT课件

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1、实验十七 单细胞凝胶电泳技术——丁书茂单细胞凝胶电泳技术——丁书茂单细胞凝胶电泳技术(singlecellgelelectrophoresis,SCGE),也称彗星试验(cometassay),是OstlingO和JohansonKJ首次提出,后经Singh等进一步完善的一种在单个细胞水平上检测DNA损伤、交联和修复的方法。因其简单、灵敏、低耗、快速等优点而广泛应用于生物检测、遗传毒理、流行病学调查等诸多方面。一、实验原理DNA链多为磷酸复合物,在生理条件下DNA的多聚核酸链多呈阴离子状态,当外源性因素(如紫外照射)造成DNA链断裂时,负超螺旋结构变得松散,那么在电场作用下DNA就会

2、以一定速率向正极移动。在细胞裂解液作用下,细胞膜、核膜等结构受到破坏,胞内蛋白质、RNA及其它成分均扩散到溶液中,而核DNA由于分子量大而只能留在原位。经碱处理和在碱性电解质的作用后,DNA解旋,损伤的DNA断链及其片段会被释放出来,而在电泳条件下,DNA片段可进入凝胶孔隙发生迁移。由于这些DNA分子量很小,所以在电泳过程中会离开核DNA向正极移动,形成彗星状的图像。在一定条件下,DNA迁移距离和DNA含量分布与DNA损伤程度呈线性相关。随着DNA损伤程度加剧,断片数目增加,表现为尾部DNA含量增加,彗尾延长,荧光强度加强。二、实验流程采用碱性SCGE,其基本操作过程包括:1.细胞制

3、取取处于对数生长期的Hela细胞,吹打为单细胞悬液,用PBS调节细胞密度为105-106个/ml。2.细胞染毒染毒组:取1ml细胞悬液加入10-3MH2O2溶液50μl,混匀,37℃水浴30min;阴性对照组:取1ml细胞悬液加入50μlPBS缓冲液,同等条件下水浴30min。3.制片第一层胶:在完全磨毛的载玻片上铺180μL质量分数为1%的正常熔点琼脂糖(NMA),室温固化10min;可将玻片用吹风机稍微加热,以延缓琼脂糖凝固。第二层胶:取50μL质量分数为0.8%的低熔点琼脂糖(LMA)和30μL的细胞悬液,混匀后滴加于第一层胶上,加该盖片使其均匀铺开,4℃凝固10min;第三层

4、胶:移开盖片,滴加100μL质量分数为0.5%的LMA于第二层胶上,加盖片,4℃凝固10min。4.裂解将制好的凝胶放入冷的裂解液中,4℃下裂解2小时;裂解液使用时新配(铺完第二层胶后即可配制)90mllysissolution10mlDMSO1mlTriton-X1005.解旋从裂解液中将载玻片取出,在蒸馏水中洗去过多盐,晾干。将新配制的电泳缓冲液倒入电泳槽中,约覆过载玻片0.25cm,盖上盖子,在高pH电泳缓冲液中放置20min以便DNA解螺旋。6.电泳室温下调节缓冲液液面高低,于20V,200mA下电泳20min。7.中和将凝胶浸入0.4MTris缓冲液(pH7.5)中,浸洗3

5、0min。8.染色观察用20μg/L的吖啶橙染色3-5min,用双蒸水洗掉表面的染料,24小时内在荧光显微镜下观察。三结果观察四注意事项实验操作均在红光或暗处条件下进行,以避免造成DNA的额外损伤。关键步骤是铺胶,尤其是第一层胶,一定要平整,均匀。若有气泡,用下一层胶填平。配制裂解液时,DMSO为致癌剂,注意安全。用去尖的枪头取Triton-X100五思考题试分析三层胶浓度不同的原因。试分析影响单细胞凝胶电泳实验结果的因素。

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