抗HER2重组免疫毒素scFv C6.5－TNF-α和scFv C6.5－sTrail的构建与活性研究

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1、分类号Q93密级UDC编号中国科学院研究生院博士学位论文抗HER2重组免疫毒素scFvC6.5－TNF-α和scFvC6.5－sTrail的构建与活性研究蒋琳指导教师吴文芳研究员中国科学院沈阳应用生态研究所申请学位级别博士学位学科专业名称微生物学论文提交日期2005年5月论文答辩日期培养单位中国科学院沈阳应用生态研究所学位授予单位中国科学院研究生院答辩委员会主席张成刚研究员ADissertationinMicrobiologyConstructionandBioactivityofRecombinantAn

2、ti-HER2/neuImmunotoxinContainingHumanCytokinesTNF-αorsTrailByJiangLinSupervisor:ProfessorWuWen-FangGraduateSchoolChineseAcademyofSciencesMay2005摘要摘要HER2/neu基因在肿瘤中的过度表达使其成为许多肿瘤的标志分子。人肿瘤坏死因子（TNF-α）和肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（Trail）对肿瘤细胞的杀伤作用使其成为前景看好的抗肿瘤药物，对它们的细胞杀伤机制研究日

3、渐深入。但临床研究发现HER2/neu过度表达的肿瘤细胞抵制TNF-α和Trail的肿瘤杀伤作用，因此经常产生耐药现象。为了增加过度表达HER2/neu的肿瘤细胞对TNF-α的敏感性和提高HER2/neu抗体的肿瘤杀伤效应，我们将抗HER2/neu人源化单链抗体scFvC6.5与人TNF-α融合，构建了免疫毒素scFvC6.5－TNF-α，完成了该重组蛋白在大肠杆菌中的表达，产率为800μg/L菌液。经过亲和层析和柱复性，融合蛋白的纯度达95％以上。ELISA试验表明scFvC6.5－TNF-α能够特异结合

4、HER2/neu阳性卵巢癌细胞SKOV-3和乳腺癌细胞MCF-7，而不结合HER2/neu阴性的黑色素瘤细胞A-375。MTT试验表明scFvC6.5－TNF-α能够选择性的杀伤SKOV-3和MCF-7细胞，而不影响A-375细胞的生长。同时为了增加过度表达HER2/neu的肿瘤细胞对人可溶性肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（sTrail）的敏感性和提高HER2/neu抗体的肿瘤杀伤效应，我们构建了scFvC6.5与人sTrail的融合蛋白scFvC6.5－sTrail。重组子经酶切及测序证明序列正确后，在大

5、肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达。经SDS-PAGE及Western-blot鉴定，获得高水平包含体表达菌株，产率为700μg/L菌液。对表达产物进行变性、复性及纯化，SDS-PAGE结果显示纯度达95％以上。用ELISA法检测纯化后蛋白的结合活性表明融合蛋白scFvC6.5－sTrail能够特异结合HER2/neu阳性卵巢癌细胞SKOV-3、乳腺癌细胞MCF-7和Trail敏感菌株MDA-MB-231，而不结合HER2/neu阴性和Trail受体阴性的黑色素瘤细胞A-375。MTT法检测其生物活性显

6、示纯化后的scFvC6.5－sTrail蛋白对SKOV-3、MCF-7、MDA-MB-231均具有细胞毒活性，并存在剂量依赖性，但对A-375细胞没有作用。细胞流式分析表明这两种免疫毒素对SKOV-3靶细胞的杀伤作用是通过诱导细胞凋亡所致，。提示这两种免疫毒素在抗肿瘤靶向治疗中具有潜在的应用价值。关键词：免疫毒素，肿瘤坏死因子，肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体，抗HER2/neu单链抗体I抗HER2重组免疫毒素scFvC6.5－TNF-ɑ和scFvC6.5－sTrail的构建与活性研究Construction

7、andBioactivityoftwoRecombinantanti-HER2/neuImmunotoxinsJiangLin(Microbiology)DirectededbyProfessorWuWen-FangAbstractHER2/neuisanattractivetargetfortumortherapysinceitisoverexpressedinanumberoftumors.Thetumornecrosisfactor(TNF-α)andtherecombinantsolubleTNF-

8、relatedapoptosis-inducingligand(sTrail)havebeennowconsideredtwopotentialtherapeuticagentstotreathumancancersbecausethattheirapparentapoptosis-inducingtumorcellsdeathhavebeenobservedinvitroandinvivo.Howeverrec