重组抗her2 scfv -tbid基因的表达及其对乳腺癌skbr论文

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1、重组抗HER2ScFv/tbid基因的表达及其对乳腺癌SKBr论文王芳，裘秀春，王立锋，许彦鸣，赵晶，孟艳玲，贾林涛，王成济.freelembranedomainandtbidpcDNAbidplasmidbyrestrictionenzymedigestion,andthenclonedintovectorpCMVandtherebinantplasmidpCMVrpbidandmorphologicchangesofSKBr3cellsmunofluorescentstaining.MTTtestidoftransf

2、ectedSKBr3cells.MTTtestandindirectimmunofluorescentstainingshos;apoptosis;ScFvantibody【摘要】目的：观察构建的重组抗HER2ScFv/tbid基因在SKBr3细胞中的表达及其对转染的SKBr3细胞的作用.方法：用限制性内切酶双酶切已构建的pcDNAbid质粒，获得带有PE转膜结构域和tbid的重组基因，将所获基因插入到真核表达载体pCMV单链抗体基因ScFv23e的下游，转染SKBr3细胞.间接免疫荧光法检测目的蛋白的表达，MTT法检测

3、目的基因转染后细胞的增殖情况.结果：转染SKBr3细胞后，检测出目的蛋白的表达.MTT实验发现细胞的增殖被明显抑制.间接免疫荧光双标记染色检测tBid的表达，并可观察到Cytc在细胞质中存在，SKBr3细胞出现凋亡.结论：重组抗HER2ScFv/tBid分子可以在转染的SKBr3细胞中表达，并且可抑制转染细胞的生长，诱导细胞发生凋亡.0引言Bid（BH3interactingdeathagonist）是Bcl2（Bcelllymphoma2）家族蛋白，编码区cDNA长588bp，编码表达产物长度为195个氨基酸，分子质量

4、为22×103.Bid只含有一个BH3结构域（9098aa的区域），而没有Bcl2家族成员的其他保守区域（如：BH1，BH2，BH4），也没有大部分Bcl2家族成员所具有的C末端疏水的膜锚定区域.Bid分子定位于胞质，能够被caspase8，GranzymeB等剪切活化，去除N末端后，截短的Mr15×103片段（truncatedBid，tBid）从细胞质转位到线粒体，使线粒体通透性改变，释放细胞色素c和其他的促凋亡分子调节细胞凋亡［1-2］.乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一.有30%左右的乳腺癌患者HER2特异性高表达

5、，并且HER2表达量越高，肿瘤的恶性程度越高，患者预后也越差［3-4］.本研究中所构建的靶向重组促调亡分子是以HER2为靶点，旨在研究该重组蛋白对乳腺癌SKBr3细胞的促凋亡作用.1材料和方法1.1材料DH5α感受态细菌，pCMV空载体，pCMVimmunocaspase6质粒［5］，pcDNA3bid质粒［6-7］，人乳腺癌细胞系SKBr3由第四军医大学生物化学与分子生物学教研室保存；RPMI1640，脂质体Lipofectamine2000TM，新生牛血清及反转录试剂盒（Invitrogen公司）；山羊抗人Bid，兔

6、抗人Ctyc多克隆抗体（SantaCruz公司）；Biotin标记的兔抗山羊IgG,FITC标记的驴抗兔IgG，DAPI，AvidinCy3（MolecularProbes公司）；限制性核酸内切酶HindⅢ,XbaⅠ,EcoRⅠ,NotⅠ,T4DNAligase（TaKaRa公司）.1.2方法1.2.1细胞转染将处于对数生长期的SKBr3细胞用2.5g/L胰酶消化后,以1×106/孔接种于6孔板中，继续培养24h.待80%以上贴壁后，吸出培养液，用RPMI1640将细胞冲洗2遍.取3μg/孔的pCMVrpb和pCMV质粒

7、分别溶于500μLRPMI1640培养液，称为A1，A2液.将两份6μL/孔的Lipofectamine2000TM各溶于500μLRPMI1640培养液，室温孵育5min，为B1，B2液；将A1和B1，A2和B2两液分别混合,轻轻摇动,室温孵育20min，缓缓滴加至洗过的细胞中，于37℃，50mL/LCO2条件下培养8h.吸弃转染液，加入1mL含200mL/L小牛血清的无抗生素的RPMI1640培养液，继续培养.1.2.2间接免疫荧光染色制备细胞爬片，经转染48h后，以40g/L多聚甲醛固定30min,0.1mL/LT

8、ritonX100处理，30mL/LH2O2灭活内源性过氧化物酶，再以正常山羊血清进行封闭.依次加入一抗、生物素化的二抗或FITC标记的二抗、AvidinCy3和DAPI，以荧光显微镜观察并照相.1.2.3MTT实验以5×103/孔将SKBr3细胞接种于96孔板中，转染后24h，每孔加入5g/LMTT溶液20μL，3