RNA干扰技术抑制乳腺癌SKBr3细胞HER2的表达.doc

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1、RNA干扰技术抑制乳腺癌SKBr3细胞HER2的表达【摘要】构建含表皮生长因子受体2基因(HER2)的短发夹状双链RNA(shRNA)重组质粒,体外观察对人乳腺癌细胞SKBr3的HER2mRNA及蛋白表达的影响。方法利用分子克隆技术,将含HER2的双链DNA,与经双酶切后的载体pSilencer连接,构建pSilencerHER2重组质粒,在脂质体的介导下转染高表达HER2的乳腺癌细胞系SKBr3。RTPCR分析HER2mRNA的表达,Westernblot检测蛋白的表达,MTT法测定细胞增殖情况。结果酶

2、切鉴定证实重组质粒构建成功,转染后能明显抑制HER2mRNA及蛋白的表达,抑制细胞的增殖。结论构建的pSilencerHER2重组质粒能有效地降低人乳腺癌细胞HER2的表达,抑制细胞的增殖,为HER2高表达预后不良的乳腺癌基因治疗提供新策略。【关键词】RNA干扰受体表皮生长因子乳腺肿瘤瘤细胞培养的基因表达表皮生长因子受体2(HER2)在包括乳腺癌在内的多种上皮源性肿瘤中过度表达,与乳腺癌的发生、发展、预后等关系密切[1],是极具发展前途的基因治疗靶位。约有30％乳腺癌患者伴随有HER2及其基因产物的过表达[

3、2],HER2过表达是乳腺癌病人不良预后的重要标记物。RNA干扰是近年来发展起来的基因阻断技术,它通过将双链RNA(doublestrandedRNA,dsRNA)导入细胞后,在Dicer酶的作用下产生有活性的小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA),与该段RNA同源mRNA产生特异性降解,从而导致特异基因表达抑制的转录后基因沉默现象[3]。笔者采用RNA干扰(RNAi)技术抑制人乳腺癌细胞株SKBr3细胞HER2的表达,探讨利用质粒表达载体体内合成siRNA的方法能否有效介导肿瘤

4、细胞出现RNAi，从而为乳腺癌的基因治疗提供新策略。1材料和方法1.1材料1.1.1细胞株SKBr3细胞(人乳腺癌细胞株，湖南远泰生物技术有限公司)。1.1.2主要试剂MMuLV逆转录酶、TaqDNA聚合酶(立陶宛MBI公司);质粒pSilencerTM3.1H1neo(美国Ambion公司);限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ和T4DNA连接酶、100bpDNAladder(大连宝生物技术公司);RMPI1640培养基、Trizol和Lipofectamine2000(美国Invitrogen公司);M

5、TT(美国Sigma公司);鼠抗人HER2单克隆抗体(美国R&D公司);TMBWesternBlot试剂盒(美国KPL公司)。图1pSilencer质粒图谱6Fig1pSilencerplasmidmap1.2方法1.2.1构建短发夹状双链RNA(shRNA)重组质粒根据GenBank数据库提供的HER2基因序列(NM004448),按照siRNA的设计原则,利用Ambion公司在线设计软件设计siRNA序列,筛选出1个19核苷酸的靶序列,用siRNAHairpin寡核苷酸序列设计软件设计成双链发夹

6、结构,双链的5’端引入BamHⅠ位点,3’端引入HindⅢ位点,中间9个核苷酸是用于形成发夹结构,在3’端有一个TTTTTT的终止信号。DNA正义链：5’GATCCGGACATCTTCCACAAGAACTTCAAGAGAGTTCTTGTGGAAGATGTCCTTTTTTGGAAA3’DNA反义链：3’GCCTGTAGAAGGTGTTCTTGAAGTTCTCTCAAGAACACCTTCTACAGGAAAAAACCTTTTCGA5’由大连宝生物工程公司合成,2条DNA链退火形成双链DNA,与线性化载体在1

7、6℃连接过夜,无义对照质粒由美国Ambion公司提供,转化感受态大肠杆菌。随机挑选转化菌落,小量提取质粒,进行酶切鉴定,鉴定正确的shRNA重组质粒(pSilencerHER2)进行测序。1.2.2细胞培养人乳腺癌细胞SKBr3,用含10%小牛血清的RPMI1640培养基,于37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中常规培养和传代。1.2.3细胞转染转染前1d,将SKBr3细胞接种6孔板,每孔3×105,3mL,置37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱培养过夜,待细胞生长融合达85%~90%后,采用siP

8、ORTXP1试剂(美国Ambion公司)按说明书方法进行转染,每孔加入脂质体2.0μL和重组质粒pSilencerHER21.0μg,同时转染无义质粒(pSilencerneospecial)作为对照。转染48h后检测目的基因的表达。1.2.4RTPCR检测HER2基因表达用Trizol按说明书方法抽提转染48h后细胞总RNA,用紫外分光光度计定量,经MMlv酶反转录为cDNA。采用Pri