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1、附件一抗谷氨酸损伤少突胶质细胞的药物筛选模型【背景和目的】谷氨酸是神经系统内重要的兴奋性递质。在脑缺血、多发性硬化等多种病理条件下，脑内谷氨酸浓度异常增高，导致少突胶质细胞膜上的谷氨酸受体过度激活，Na+和Ca2+大量内流，引起细胞肿胀、钙稳态失衡，最终导致细胞损伤。通过建立拮抗谷氨酸损伤少突胶质细胞的药物筛选模型，将有利于寻找拮抗谷氨酸受体或通过其他途径拮抗少突胶质细胞兴奋性毒性的有效候选化合物或中药单体，为减少少突胶质细胞在病理条件下的损伤、增强少突胶质细胞保护提供新的治疗药物。【材料】细胞系：OLN-9
2、3试剂：DMEM，FBS，谷氨酸，PBS，胰蛋白酶，MTT，DMSO，NBQX；仪器：二氧化碳培养箱，离心机，倒置显微镜，酶标仪【实验步骤】1.OLN-93细胞系培养使用含10%FBS的DMEM培养细胞，3-4天传代一次。细胞多为双极突起，长度较短。将细胞接种于96孔板后更换分化培养基（含0.5%FBS或1%FBS的DMEM），分化4-5天后细胞突起增加，相互连接形成近似网状结构，可进行后续实验。2.模型建立取生长状态良好、融合度约60-70%的OLN-93，以3.0×104/ml的密度接种于96孔板中，每孔
3、含200μl分化培养基，分化4-5天后开始实验。设置调零组、对照组和谷氨酸损伤组，每组3-6个复孔。对照组加入无血清培养基，谷氨酸损伤组加入使用无血清DMEM新鲜配制的谷氨酸（终浓度为20-40mM），每孔终体积为100μl。培养8小时或24小时后，每孔加入10μlMTT（5mg/ml）继续孵育3-4h，测定OD560nm，计算细胞存活率。选取细胞存活率在20%-60%的谷氨酸浓度作为参考造模浓度。3．模型验证阳性药为非NMDA受体拮抗剂NBQX，使用DMSO配制成30mM母液，在谷氨酸损伤的同时加入细胞培养
4、基中，NBQX终浓度为150μM。对照组为在谷氨酸损伤的同时加入等浓度的DMSO。6种候选化合物均以DMSO溶解，配制为10mM的母液，-20℃冻存。加药前使用PBS梯度稀释，在谷氨酸损伤的同时加入细胞培养基中，终浓度为1μM和10μM。【实验结果】1．谷氨酸损伤细胞的量效反应和时效反应使用20-40mM谷氨酸损伤细胞，损伤时间为8小时或24小时。结果表明谷氨酸对OLN-93的细胞活力的影响具有一定的时间和浓度依赖性（图1）。选择30mM谷氨酸损伤24h作为模型建立的条件，此时细胞存活率降低至40%左右。图1
5、谷氨酸对少突胶质细胞活力的影响具有时间和浓度依赖性。结果表示为Mean±SD。2．模型验证结果阳性药NBQX在150μM时表现出一定的保护作用，可使细胞损伤减少20%左右。筛选的6种化合物中只有第三种化合物表现出显著的保护作用，其他药物无保护作用或作用微弱（图2）。图2NBQX可拮抗谷氨酸对少突胶质细胞的损伤。六种化合物中3和4号化合物表现出显著作用，其他化合物作用微弱或无作用。结果表示为Mean±SD，数据采用ANVOA进行统计分析，与DMSO组相比，**p<0.01，***p<0.001。【结论】OLN-
6、93分化4-5天后表现出未成熟少突胶质细胞的形态，细胞突起明显增多，谷氨酸可降低OLN-93细胞活力，并具有一定的时间和浓度依赖性。确定谷氨酸损伤模型的造模条件为30mM谷氨酸损伤24h，细胞存活率可降低至40%左右。通过该模型验证了非AMPA受体拮抗剂NBQX可减少谷氨酸对OLN-93的损伤作用。【参考文献】1)VulnerabilityofOligodendrogliatoGlutamate:Pharmacology,Mechanisms,andPrevention.AkiraOka,MichaelJ.B
7、elliveau,PaulA.Rosenberg,JosephJ.Volpe.TheJournalofNeuroscience,1993,13(4):1441-1453.2)Oligodendrocyteexcitotoxicitydeterminedbylocalglutamateaccumulationandmitochondrialfunction.WenbinDeng,QinYue,PaulA.Rosenberg,JosephJ.Volpe,FrancesE.Jensen.JournalofNeuro
8、chemistry,2006,98:213–222.3)NBQXAttenuatesExcitotoxicInjuryinDevelopingWhiteMatter.PamelaL.Follett,PaulA.Rosenberg,JosephJ.Volpe,andFrancesE.Jensen.TheJournalofNeuroscience,2000,20(24):9235–9241.4)Olig
