《LAM修改》PPT课件

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1、9/7/20211GEHBGCHULAM第二章基因工程的主要技术原理9/7/20212GEHBGCHULAM由于提取DNA的目的、种类、所用的生物、组织材料、实验条件等不同，DNA的提纯有很多方法。其中最常用的是碱抽提法。第一节DNA的提取与纯化9/7/20213GEHBGCHULAM核酸分离、纯化原则保持核酸分子一级结构的完整性分离核酸原则：1）温度不要过高；2）控制pH值范围(pH值5-9);3）保持一定离子强度;4）减少物理因素对核酸的机械剪切力.5)尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏9/7/

2、20214GEHBGCHULAM核酸的纯化应达到以下要求1.核酸样品中不存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；2.其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低程度；3.排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时应去除RNA，反之亦然。9/7/20215GEHBGCHULAM防止核酸的生物降解细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。9/7/20216GEHBGCHULAM1细胞的破碎2核蛋白的解聚、变性蛋白的去除3核酸

3、的沉淀4核酸的浓度测定5核酸的保存分离提取核酸的主要步骤9/7/20217GEHBGCHULAM9/7/20218GEHBGCHULAM大肠杆菌基因组DNA9/7/20219GEHBGCHULAM一、质粒DNA的提取9/7/202110GEHBGCHULAMplasmidDNAThegenomicDNAofE.coli:asinglecirculardouble-strandedDNA,withthecontourlengthabout850timeslongerthanthecell.GenomicDNA9/7/202111

4、GEHBGCHULAM闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；（1）原理1.碱抽提法提取质粒DNADNA双链变性DNA单链复性强碱中性9/7/202112GEHBGCHULAM染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。变性9/7/202113GEHBGCHULAM（2）所用的试剂作用①溶菌酶能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1，4糖苷键。在碱性条件（pH>8）下有活性。②葡萄糖增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受

5、机械力（震荡）的作用而降解。9/7/202114GEHBGCHULAM③EDTA(乙二胺四乙酸)Mg2+、Ca2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。④NaOH-SDSNaOH：强碱，提供pH>12的碱性条件，使DNA双链变性。SDS(十二烷基硫酸钠):溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白—SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。9/7/202115GEHBGCHULAM冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8。用来中和NaOH变性液，使DNA复性。高浓度的NaAc有利于变性的大分子（蛋白质、DNA、

6、RNA等）沉淀。用于沉淀DNA。⑥乙醇DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。⑤NaAc-HAc缓冲液9/7/202116GEHBGCHULAM⑦RNaseA降解RNA渣滓。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。⑧TE缓冲液DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制。Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲液），有利于以后操作；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。9/7/202117GEHBGCHULAM⑦RNaseA降解RNA渣滓。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。⑧

7、TE缓冲液DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制。Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲业），有利于以后操作；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。9/7/202118GEHBGCHULAM（3）碱抽提法提取质粒DNA的步骤SolutionI的配制：使用“溶液Ⅰ”溶解细菌细胞壁。第一步：溶菌50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA，4-5mg/ml溶菌酶，RNaseA9/7/202119GEHBGCHULAM溶液II破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。第二步：破膜，蛋白

8、质和DNA变性SolutionII的配制：第三步：中和溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物和染色体DNA、RNA沉淀。SolutionIII的配制：0.2NNaOH，1.0%SDS3M醋酸钠（用冰醋酸调pH至4.8）9/7/202120GEHBGCHULAM最重