《DNA重组》课件

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1、重组DNA技术DNARecombinationTechnique1基因克隆的原理核酸的提取和检测核酸的分子杂交PCR技术基因文库的构建基因表达2重组DNA技术的原理重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序也称为分子克隆技术,基因克隆或基因工程供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件3基因工程的操作过程酶切连接转化扩增检测目的基因的获取克隆载体的构建外源基因与载体的连接（体外重组）重组DNA导入受体菌转化子的筛选和鉴定克隆基因的表达4目的基因

2、的克隆基因工程或DNA重组技术的前提条件是从生物体中分离克隆目的基因。一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。5核酸的提取及检测就基因工程而言，核酸分子是其研究所涉及的主要对象，所以核酸的分离与提取是研究中很重要的基本技术。核酸样品的质量将直接关系到实验的成败。6基因组DNA的分离与纯化DNA主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDN

3、A），叶绿体DNA（cpDNA），质粒DNA。总的原则保证一级结构的完整性排除其它分子的污染7一般步骤(1)破碎细胞，裂解细胞壁机械方法:超声波处理、研磨、匀浆化学方法:SDS（阴离子去垢剂）EDTA，使得DNase失活(why?)酶学方法:溶菌酶或蜗牛酶(2)通过蛋白质变性或分解，使DNA游离出来(3)分离DNA8cDNA的分离与纯化（1）mRNA分离RNase，不需辅助因子，耐酸碱，分布极广RNase的来源外源：操作者，实验器皿，试剂，空气内源：不同组织和细胞数量不同创造无RNase的环境—DEPC(焦碳酸二乙酯—异硫氰酸胍Trizol试剂提问：什么是cDNA？9（2）

4、Thefirststrandsynthesis10（3）ThesecondstrandsynthesiscDNA第二链的合成方法－自身引导法11自身引导合成法较难控制反应，而且用S1核酸酶切割发夹结构时无一例外地将导致对应于mRNA5’端序列出现缺失和重排，因而该方法目前很少使用。12cDNA第二链的合成方法－置换合成法利用第一链在反转录酶作用下产生的cDNA:mRNA杂交链，不用碱变性（水解mRNA），而是在dNTPs存在下，利用RNA酶H在杂交链的mRNA链上造成切口和缺口。从而产生一系列RNA引物，使之成为合成第二链的引物，在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成第二链。

5、注意：反转录酶除了具有聚合活性，还有RNaseH（降解DNA/RNA中的RNA）活性。13cDNA第二链的合成方法－置换合成法DNApoldNTPsRNaesH5‘ppp’5GGAAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’AAAAAAAAAAAAAAp5’5’S1AAAATTTOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’5’TTTTTTTTTTTTTTOH3’AAAAAAAAAAAAAA5’5’TTTTTTTTTTTTTT3’3’T4-DNAligase该方法使用较多14质粒DNA的分离与纯化质粒plasmid:指细菌细胞质中独立于细菌染色体之外能自

6、主复制的遗传单位共价闭合环状质粒DNA的分离：细菌培养和质粒DNA扩增；细菌菌体的裂解；质粒DNA的分离15质粒DNA－碱裂解法原理染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。16核酸的检测包括DNA的质量、大小、纯度检测分光光度计法dsDNA：1A260≈50ug/mlssDNA，RN

7、A：1A260≈40ug/ml寡聚核苷酸：1A260≈20ug/mlA260/A280＝1.65～1.85（DNA）；2.0(RNA)比值高，有蛋白质、酚类等污染（why?）凝胶电泳法17凝胶电泳技术样品的物理性质分子大小、电荷、空间构型支持物介质琼脂糖，100-60000bp,聚丙烯酰胺，1-500bp电场强度，5V/cm缓冲液离子强度TAE,TBE,TPE18琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力凝胶类型及浓度分离DNA片段的大小(bp)Agarose0.350000~10000.720000~10001