《ACP比活分析》PPT课件

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1、小麦胚芽ACP活性测定临床生物化学实验室一、实验目的掌握酸性磷酸酶（ACP）活性测定的原理和方法；熟悉酶活性测定结果的计算。二、实验原理ACP的作用是能水解磷酸单酯键，释放无机磷酸。ACP的水解作用特异性不高，有ATP、ADP和G-6-P等为其天然底物，人工合成的底物有磷酸苯二钠、对硝基磷酸酚等。二、实验原理本实验利用提取液为酶制剂，以磷酸苯二钠作为底物，酸性环境中，在ACP的作用下，可水解生成酚和磷酸。在碱性溶液中酚能与4-氨基安替比林作用，经高铁氰化钾氧化生成红色醌类化合物，在波长510nm处测定其吸光度值，其颜色深浅与酚的含量成正

2、比，通过比色测定可推算出酶的活性。二、实验原理三、实验试剂酚标准贮存液(1mol/L)：用0.1mol/L的HCl溶液配制，冰箱保存。酚标准应用液(0.4mmol/L)：用酚标准贮存液加蒸馏水稀释而成。0.1mol/L碳酸盐缓冲液(pH10.0)：称取碳酸氢钠3.36g，无水碳酸钠6.36g，用蒸馏水溶解至1000ml。4-氨基安替比林(4-AAP)溶液：称取4-氨基安替比林6g，用蒸馏水溶解并定容至1000ml，置棕色瓶中冰箱保存。0.1mol/L柠檬酸溶液：称取柠檬酸21.014g，加蒸馏水溶解并定容至1000ml。三、实验试剂高铁

3、氰化钾溶液：称取硼酸28g，高铁氰化钾48g，各自溶解于400ml蒸馏水中，两液合并后再加蒸馏水至1000ml，置棕色瓶中保存。5mmol/L磷酸苯二钠溶液：称取磷酸苯二钠0.635g，加入500ml煮沸的蒸馏水中溶解，冷却后加氯仿2ml防腐，冰箱保存。0.1mol/L柠檬酸三钠溶液：称取柠檬酸三钠29.410g，加蒸馏水溶解并定容至1000ml。0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液(pH5.0)每100ml缓冲液按0.1mol/L柠檬酸三钠溶液59ml加0.1mol/L柠檬酸溶液41ml配制而成。四、操作步骤1.校正曲线的制作加入

4、物(ml)B12345酚标准液0.00.20.40.60.81.0蒸馏水1.00.80.60.40.20碳酸盐缓冲液3.03.03.03.03.03.04-AAP溶液0.50.50.50.50.50.5铁氰化钾溶液0.50.50.50.50.50.5相当于酚含量（nmol）0100200300400500立即混匀后，室温放置10min,以B管调零,于510nm波长处比色，读取各管吸光度。以吸光度值为纵坐标，相应的酚含量为横坐标绘制校正曲线。四、操作步骤2.各上清液中ACP活性的测定上清液标本的准备：从各上清液中取0.5ml于另5支试管，

5、再分别加入4.5ml蒸馏水进行10倍稀释。四、实验操作2.各上清液中ACP活性的测定加入物(ml)BⅠⅡⅢⅣⅤ上清液—0.10.10.10.10.1蒸馏水0.1—————柠檬酸缓冲液0.20.20.20.20.20.2磷酸苯二钠溶液0.10.10.10.10.10.137℃水浴15min蒸馏水0.60.60.60.60.60.6碳酸盐缓冲液3.03.03.03.03.03.04-AAP溶液0.50.50.50.50.50.5铁氰化钾溶液0.50.50.50.50.50.5混匀，室温放置10min，以B管调零，510nm处比色读取吸光度值

6、。五、结果计算1.酶活性单位换算根据测得的各上清液吸光度值，从校正曲线上查出相应的酚含量，乘上稀释倍数，再换算出“μmol/(ml·min)”的活性单位。酶活性单位=其中，酶促反应的时间为15min，酶促反应中所用的上清液体积为0.1ml。ACP活性单位的定义：每分钟每毫升酶液产生1nmol酚[nmol/(ml·min)]为一个活性单位。酚含量×稀释倍数反应体积×反应时间五、结果计算2.酶的比活分析蛋白质回收率（%）=×100%酶回收率（%）=×100%比活性=纯化倍数=各上清液总酶活力上清液Ⅰ蛋白质总含量各上清液蛋白质总含量上清液Ⅰ总

7、酶活力总酶活性(nmol/min)总蛋白质含量（mg）各上清液比活性上清液Ⅰ比活性五、结果计算数据记录表总体积蛋白质浓度总蛋白总蛋白回收酶活性总酶活性总酶回收比活性纯化倍数mlmg/mlmg%nmol/(ml·min)nmol/min%nmol/(min.mg)上清液Ⅰ上清液Ⅱ上清液Ⅲ上清液Ⅳ上清液Ⅴ六、注意事项准确掌握酶促反应的时间，实验时要控制在同一条件下进行。若上清液的酶活性过高，超过了校正曲线的线性范围，需要稀释后再测，结果乘上稀释倍数。比活性是指每毫克蛋白质所具有的酶活性，一般用酶单位/毫克蛋白质表示。比活性是酶学研究经常使

8、用的数据，比活性越高，每单位重量酶蛋白的催化能力越强，表示酶制剂越纯。六、注意事项通过计算各纯化步骤中蛋白质、酶的回收率(得率)，可了解各步骤蛋白质与酶的提取和丢失情况，从而获得整个分离提纯过程的总回收率。