In-fusion技术

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1、In-Fusion克隆技术介绍15July2021宝日医生物技术（北京）有限公司基因克隆背景简介15July20212TA克隆限制性酶切克隆平滑末端克隆缺点：连接效率低耗时较长需要特定限制性酶切位点In-Fusion克隆产品15July20213Clontech专利In-Fusion®HDCloningSystem任意载体任意基因片段这是一款让您随心所欲地实现基因定向克隆的产品！In-Fusion®基因克隆特点4主要内容15July202152In-Fusion®优点及应用实例3In-Fusion®系列

2、产品介绍4常见问答1In-Fusion®克隆技术的原理15July20216主要内容2In-Fusion®优点及应用实例3In-Fusion®系列产品介绍4常见问答1In-Fusion®克隆技术的原理In-Fusion®基因克隆技术原理示意图In-Fusion专利酶Clontech专利In-Fusion是一种快速、简单、高效的基因克隆技术！50℃，15min单管反应715July20218主要内容2In-Fusion®优点及应用实例3In-Fusion®系列产品介绍4常见问答1In-Fusion®克隆技

3、术的原理In-Fusion®克隆技术的优点15July20219不附加任何多余序列2不受限制性内切酶酶切位点的限制3可同时克隆两个或多个DNA片段41简便、快速、高效的克隆技术简便、快速、高效的克隆技术15July202110快速！15July202111In-FusionHD无论是克隆长基因片段还是克隆多个基因片段都能保持较高的克隆效率。高效！简便、快速、高效的克隆技术不附加任何多余序列15July202112线性化载体任意载体克隆位点目的DNA片段不需要的碱基序列引物设计PCR扩增与载体相同的15个

4、碱基序列In-Fusion连接反应15min不附加任何多余序列的重组载体无缝克隆：不附加任何多余序列ABC不受限制性内切酶酶切位点的限制15July202113In-Fusion克隆不受限制性内切酶酶切位点的限制:在cDNA序列中插入内含子,荧光蛋白基因在cDNA序列添加UTRs转换纯化标签例如Myc转换为His缺失蛋白表达区域…表达载体选择插入位点PCR扩增纯化目的DNA片段混合In-FusionIn-Fusion引物设计PCR扩增重组载体可同时克隆两个或多个DNA片段15July202114Step

5、2:目的DNA片段扩增Step3:一次In-Fusion连接反应Step1:制备线性化载体片段1片段2片段3线性化载体重组载体克服传统克隆技术的限制15July202115克服其它克隆技术的限制其它克隆技术的限制In-Fusion解决方案载体的限制不同克隆试剂盒都需要与之匹配的载体必须使用提供的载体只要载体末端和插入片段末端具有15个同源碱基，In-Fusion就可以将任意PCR片段插入任意线性化载体中。必须进行限制性内切酶酶切和连接需要独一无二、兼容的酶切位点极少的合适酶切位点In-Fusion不受限

6、制性酶切位点的限制，因此在目的片段及使用的载体中是否存在合适的酶切位点并不妨碍克隆。亚克隆繁琐多片段不能同时克隆In-Fusion能够在一次反应中同时克隆多个片段，无需进行亚克隆。对于大片段克隆效率较低对于插入片段有限制In-Fusion系统能够高效克隆0.05-15kbDNA片段。非定向克隆需要筛选目的片段插入方向正确的克隆In-Fusion是基因定向克隆技术，因此无需进行目的基因片段正确插入的克隆的筛选。会附加多余碱基序列In-Fusion是无缝克隆：不附加任何多余碱基序列。不适合中型和大规模克隆工

7、程In-Fusion技术已经成功用于多项高通量克隆工程。In-Fusion®克隆技术的应用15July202116应用多片段克隆构建载体模型插入突变位点高通量克隆15July202117应用实例实例：多个DNA片段（1kb,2kb,3kb)同时克隆【方法】使用TaKaRa高品质PCR酶分别扩增1kb、2kb、3kb的目的DNA片段和2.7kb的载体，并将扩增产物混合，使用In-Fusion®HD试剂盒完成克隆。利用高效率的感受态细胞StellarTMCompetentCells（产品编号：636763）

8、转化并进行蓝/白斑筛选。引物设计及目的基因片段扩增15July202118引物的5’末端必须包含与载体末端相同的15个碱基序列引物的3’末端必须包含与目的基因片段相互补的特异碱基序列载体线性化15July202119PCR扩增酶切处理In-Fusion连接反应15July202120In-Fusion专利酶线性化载体目的基因片段反应液直接转化In-Fusion连接反应50℃15min【结果】CloningEnhancer处理，37℃15mi