鸡蛋清溶菌酶提取实验具体步骤

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1、从鸡蛋中提取溶菌酶的步骤1.鸡蛋清样品制备及粗分离将4～5个（为一个小组，同时两个小组共同进行试验）新鲜鸡蛋打入烧杯然后用矿泉水瓶子吸出蛋黄，分离得鸡蛋清（鸡蛋清pH值不得小于8.0），量其体积（量筒50ml），加入两倍蛋清体积的（可用双蒸水替代）去离子水，边加边缓慢搅拌，拌匀后用两层纱布过滤除去脐带块和碎蛋壳等，然后用1mol／L的HCl溶液调pH值至7.0左右，再用脱脂棉过滤收集滤液。2.724弱酸性阳离子交换树脂的再生及层析1.吸附：将处理好的蛋清约200mL，加入32g再生的724树脂中，缓慢搅拌吸附6h。2.洗涤、洗脱：待分层后，将蛋清液倒去

2、，用去离子水反复冲洗，以去除杂蛋白，滤干树脂，用等体积的0.15mol／LpH值为6．5的磷酸缓冲液洗涤，加入等量的10％（NH4）2SO4溶液搅拌洗脱30min，使溶菌酶从树脂上洗脱下来，收集洗脱液，4℃冰箱静置过夜。第二天，有白色沉淀析出，离心（15min，10000r／min）收集沉淀，沉淀物为溶菌酶粗产品浓缩1·透析除盐、去碱性蛋白：4℃条件下，用去离子水透析24h左右（1天）直到透析完全（用BaCl2与透析液发生反应直到没有浑浊产生为止）。离心去除透析袋中沉淀，向透析清液中慢慢加入1mol／L氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，使pH值上升至8．0～

3、9．0，如有白色沉淀，即离心去除；（碱性蛋白在此pH条件下会到等电点然后就会沉淀）2·聚乙二醇浓缩：盐析物用1倍去离子水溶解成稀糊状，装入透析袋，在装有聚乙二醇的试管中吸水浓缩，收集浓缩液；3·冷冻干燥：用3mol／L盐酸调pH值至5．0，冷冻干燥，即得白色片状溶菌酶。溶菌酶纯度检测SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳法①凝胶板的制备：用30％分离胶贮液、pH值为8.9分离胶缓冲液、10％浓缩胶贮液、pH值为6.7浓缩胶缓冲液、10％SDS、1％TEMED、重蒸馏水、10％APS溶液配制而成；②溶菌酶的处理：用磷酸缓冲液制成50μg／mL的溶液，取10~80μL

4、点样于凝胶板上③电泳：电流为10mA，时间4h；④固定、染色和脱色：电泳完毕，将胶板从玻璃板上取下，分别在固定液与染色液中浸泡10～30min，用水漂洗干净，再用脱色液脱色。周五周六周日鸡蛋处理1h树脂吸附6.5h洗涤洗脱2h凝胶溶胀透析除盐24h装柱5h聚乙二醇浓缩4h冷冻干燥3h层析4h凝胶检验4h第一天鸡蛋处理：a)将4～5个（为一个小组，同时两个小组共同进行试验）新鲜鸡蛋打入烧杯然后用矿泉水瓶子吸出蛋黄，分离得鸡蛋清（鸡蛋清pH值不得小于8.0）。b)量其体积（量筒50ml），加入两倍蛋清体积的（可用双蒸水替代）去离子水，边加边缓慢搅拌，拌匀后

5、用两层纱布过滤除去脐带块和碎蛋壳等。c)向透析清液中慢慢加入1molL氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，使pH值上升至8～9，如有白色沉淀，即离心去除；（碱性蛋白在此pH条件下会到等电点然后就会沉淀）树脂吸附：A.将处理好的蛋清约200mL，加入32g再生的724树脂中(抽滤去除缓冲液)，缓慢搅拌吸附6h。B.3000r/min离心15min，将蛋清回收，用去离子水反复冲洗，直至洗液无浑浊，滤干树脂。C.用等体积的0.15mol／LpH值为6．5的磷酸缓冲液洗涤。D.用等体积的0.15mol／LpH值为6．5的磷酸缓冲液洗涤15min，重复2次，最后一次除

6、去树脂水分。E.加入等量的10％（NH4）2SO4溶液搅拌洗脱30min，使溶菌酶从树脂上洗脱下来，抽滤收集洗脱液。F.每83ml洗脱液加32克细磨的固体（NH4）SO4,缓慢加入（NH4）SO4搅拌待完全溶解后，封口4℃冰箱静置过夜。凝胶溶胀：1)称取7gSephaexG-75于250ml烧杯中，加入洗脱液140ml，室温溶胀2天。第二天透析除盐：1)第一天的洗脱液会有白色沉淀析出，离心（15min，10000r/min）收集沉淀，沉淀物为溶菌酶粗产品。2)将上述沉淀用1ml蒸馏水分两次洗下，装入透析袋。3)4℃条件下，用去离子水透析，期间多次换水，

7、直到透析完全（用BaCl2与透析液发生反应直到没有浑浊产生为止）。到此为止所有的试验项目均是有两个平行凝胶层析：测柱床总体（Vt）：1·取洁净的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。在距柱上端约3cm处作一记号。2·关闭柱出水口，加入去离子水，打开出水口，液面降至柱记号处即关闭出水口。3·然后用量筒接住柱中去离子水（水面降至层析玻璃筛板），读出的体积即为柱床总体积Vt。装柱：4·在柱中注入已脱气洗脱液（约1/3柱床高度）。5·将溶胀好的凝胶与洗脱液1：3混匀稀释后缓慢倾入柱中。6·待凝胶沉积约1cm~2cm高度后打开出水口，常压平衡，胶面上升到柱记号处则装柱完

8、毕，注意装柱过程中凝胶不能分层。7·然后关闭出水口，静置过夜，等凝胶完全沉降。过夜后的凝胶柱内