鸡蛋清溶菌酶的提取及电泳鉴定

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1、鸡蛋清溶菌酶的提取及电泳鉴定药学院2010-12-19实验目的：1了解鸡蛋清溶菌酶的性质、常用制备方法及原理2掌握盐析法分离蛋白质原理及操作3掌握SDS-PAGE鉴定蛋白纯度的原理及操作1溶菌酶的性质溶菌酶(Lysozyme,EC3.2.1.17)由英国细菌学家弗莱明(Fleming)在1922年在人的眼泪、唾液中发现的。广泛存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的泪液、唾液、血浆、尿、乳汁、其它体液中及白细胞和组织（如肝、肾）细胞内，而且部分植物、微生物中也含有此酶。人溶菌酶的活性是最高的，大约为鸡蛋清溶菌酶酶活力的3倍。但是蛋清中溶菌酶含量最丰富，约为0.3%-0.4%左右，而且

2、蛋清来源广泛，因此多数商品溶菌酶是从蛋清中提取的。鸡蛋清溶菌酶是动植物中溶菌酶的典型代表，也是目前了解最清楚的溶菌酶之一。白色、无臭结晶粉末，味甜，易溶于水，遇碱易破坏，不溶于丙酮、乙醚中。其分子是由129个氨基酸残基排列构成的单一肽链，有四对二硫键，分子量为14300。碱性球蛋白，碱性氨基酸残基及芳香族氨基酸如色氨酸残基的比例很高。其等电点为pH10.7；其最适pH值为pH7左右，最适温度为50℃。不规则的椭圆体，比较容易结晶，结晶形状随结晶条件而异，有菱形八面体、正方形六面体及棒状结晶等。用X射线衍射测得此酶的体积为45×30×30Ǻ。性质非常稳定：当pH值在1.2-11.3

3、范围内剧烈变化时，其结构几乎不变。遇热也很稳定，pH值4-7、100℃处理1分钟仍保持原酶活性；pH值5.5、50℃加热4小时后，酶活不受影响。但是，在碱性条件下，溶菌酶的热稳定性较差，易变性。热变性随着有机溶剂的增加而直线下降。溶菌酶对变性剂相对不敏感。在6M盐酸胍溶液中，酶完全变性，但在8M尿素中则不变性。吡啶、十二烷基磺酸钠等对酶有抑制作用，氧化剂能使酶钝化。2溶菌酶的应用水解N-乙酰葡萄糖胺与N-乙酰胞壁酸之间β-1，4糖苷，破坏革兰氏阳性细菌细胞壁而具有溶菌作用，是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，又称细胞壁溶解酶（Muramidase）。医疗、食品防腐及生物工程中，

4、特别是在食品防腐方面，以代替化学合成的食品防腐剂，具有较好应用价值。2.1食品工业上的应用选择性的分解微生物的细胞壁，而不能作用于其它物质，主要应用于海产品、水产品、乳制品和干酪的保鲜，低度酒、糕点及饮料的防腐，以及水产熟制品及肉类熟制品的防腐保鲜。加入到饮料中，如钙奶、乳酸饮料中,也可起到防蛀牙、爽口的作用。为弥补奶粉的不足，可以向其中添加适量溶菌酶，制成母乳化奶粉，可以加强婴幼儿的抗感染能力，可以促进婴儿胃内乳酪蛋白形成细微凝乳，有利于婴儿的消化吸收。特别对早产婴儿，有防止体重减轻、预防消化器官疾病、增进体重等功效。2.2酶工程上的应用近年来，溶菌酶已成为基因工程及细胞工程必

5、不可少的工具酶，用以提取菌体内的活性物质如核酸、酶及活性多肽等。2.3发酵工业上的应用溶菌酶制备酵母膏，则不仅可以提高浸膏量的收率，还可以大大缩短酵母膏的制备时间。溶菌酶还可用于菌体内含物质的提取。2.4医学上的应用溶菌酶制备的口腔药片或漱口液治疗副鼻窦炎、口腔溃疡、扁平苔藓和渗出性中耳炎等疾病。作口服剂可抑制流行性感冒和腺病毒的生长、抗感染及抗炎症，还具有多种药理作用。还具有一定的保健作用；有促进血液凝固和止血作用；有组织再生和瘢痕形成促进作用等。2.5科学研究中的应用利用溶菌酶专一性地水解细胞壁的特点,了解微生物细胞壁的构造，分解细胞壁后制备原生质体，从而用于微生物育种以及微

6、生物分类等学术研究的领域。3溶菌酶的生产现状及前景上世纪50年代，国外开始了溶菌酶的工业化生产。采用从鸡蛋清中直接结晶得溶菌酶，产品用来制作口服药剂。上世纪60年代，又开发了离子交换法，进一步降低了生产成本，提高了产品质量，达到了注射级药品质量要求。上世纪70年代，开发了亲和色谱技术，主要用于高纯度生化试剂的生产。近来超滤法与其它方法相结合，进一步提高了溶菌酶的生产工艺水平。目前美国、加拿大、荷兰、法国、德国、丹麦、意大利、日本等国家均生产溶菌酶，其产量与日俱增。近年来，溶菌酶被用作天然防腐剂，极大的促进了其市场需求，每年以10%的速率增长，现在市场规模约为700吨。我国的食品工

7、业、精细化工业、医药工业对溶菌酶具有较大的需求。我国于上世纪70年代采用离子交换法生产溶菌酶。目前国内有大连生化、天津东原、烟台金梓等厂家生产，初步满足了国内科研及医药工业的需求。进口溶菌酶，存在着价格较高，进口环节复杂等诸多方面的限制。国产溶菌酶工业刚刚起步，生产规模小，工业水平落后，产品的质量与国际标准差距较大。存在提取率低，处理量小和产品比活低等缺点。我国是世界上最大的产蛋国家，原料来源丰富，目前鲜蛋基本作为初级食品食用，深加工不足。而发达国家的鲜蛋加工业可以加工鲜蛋总产量