普通光学显微镜的使用及微生物的简单染色

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1、实验五、普通光学显微镜的使用及微生物的简单染色⒈实验目的；⒉实验材料；⒊显微镜的构造；⒋油镜的原理；⒌实验任务；6.实验步骤；7.实验报告；8.下次实验。内容提要：实验1、观察制备好的装片；实验2、每个同学自己动手单染三张片子进行观察；一、实验目的：1.学习普通光学显微镜的构造和功能；2.学习并掌握油镜的原理和使用方法；3.学习微生物的简单染色，观察细菌的形态。返回二、实验材料：显微镜载玻片香柏油擦镜纸双层瓶染色剂滴管菌液返回三、显微镜的构造：1、机械系统（P15图1）：A）单筒显微镜：B）双筒显微镜

2、C)倒置显微镜显微镜的发展历史（补充内容）：=》=》R.虎克在17世纪中期19世纪中期的显微镜20世纪初期制做的复式显微镜的显微镜续上：带自动照相机装有场发射枪的超高压透射的光学显微镜扫描电子显微镜电子显微镜=》=》2、光学系统（P15图1）在光学系统中，物镜的性能最为关键，分为低、高、油镜头。油镜的放大倍数最大，在使用时比较特殊，需要在载玻片与镜头之间加滴镜油——香柏油。返回四、油镜的原理：放大倍数可100倍之大，焦距很短，光强度最大。油=1.52（香柏油）介质折射率水=1.33空气=1玻璃=1.55香

3、柏油对光的折射率与玻璃相似，光线直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，不但增加了照明度，而且使油镜的数值孔径增加，用NA表示，一般在1.2—1.4。低高倍镜头等干镜NA都低于1.0。若以可见光的平均波长为0.55μm来计算，数值孔径通常在0.65的高倍镜只能分辨出距离不小于0.4μm的物体而油镜的分辨率却可达到0.2μm左右。可见显微镜的放大效能是由数值孔径决定的。※什么是数值孔径？从物理学角度来看，光学显微镜的分辨率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制。可表示为：分辨率（最大可分辨距离）=/2NA=

4、光波波长，NA=数值孔径值（可见光波0.4—0.7μm）NA=n*Sina1.光线投射到物镜上的最大角度的数值孔径值一半正弦；2.乘上玻片与物镜间介质折射率积。n—介质折射率，a—最大折射角的半数光线投射到物镜的角度愈大，分辨效能就愈大。物镜的分辨孔径愈大，光波波长愈短，明显的增强分辨率——如油镜。返回五、实验任务：1、观察制备好的装片；2、每个同学自己动手单染三张片子进行观察。其中老师检查一片。返回六、试验步骤1、涂片左手持菌液试管,右手持接种环在火焰中灼烧,冷却后从试管中取菌液一滴,在洁净载玻片上

5、做一涂膜;从固体斜面或平板上取菌时,用无菌接种环取少量菌体,涂抹均匀于预先滴有的一滴自来水地玻片上;2、干燥在空气中自然干燥或在火焰快速通过干燥(与热固定同步进行).3、热固定用镊子夹住涂片一端,在火焰上连续通过几次;以载玻片在手背上试感觉不烫为宜.4、染色在固定的标本上加美兰（结晶紫）染液1-2滴,染色1min,轻轻滴加水洗;吸干,加半滴水,盖上盖玻片,滴上半滴镜油油镜检。(到此实际上即为细菌普通染色)媒染：揭去盖玻片,吸干水,滴加1-2滴革氏碘液媒染1min,轻轻水洗,吸干。5、洗脱滴加95%乙醇

6、溶液(或30%丙酮乙醇脱色),轻轻摇动玻片至液滴无色,不要过分脱色(约30秒),立即轻轻滴加水洗;吸干。6、复染滴加蕃红染液复染3min,轻轻滴加水洗;吸干载玻片背面及标本周围水渍,滴上半滴水，盖上盖玻片,油镜镜检。返回七、实验报告要求：1、根据观察的球，杆菌的观察实况画示意图，各一图。2、用油镜观察时，为什么要求载玻片上加香柏油？3、思考题(4)影响显微镜分辨率的因素有哪些？※每个同学将自己制片的观察结果，报告老师，经检查合格登记，在课堂记录册上。返回八、下次实验：微生物的革兰氏染色®请大家做好预习。返

7、回