普通光学显微镜的使用及微生物制片及染色技术

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1、普通光学显微镜的使用及微生物制片及染色技术实验目的：1、学习普通光学显微镜的使用方法.2、学习掌握单•染色的操作技术和无菌操作技术。3、了解革兰氏染色机理，并掌握其操作技术。4、掌握划线分离纯化微生物的原理与方法实验材料:1、器材：灭菌棉签（装在试管内），试管架，记号笔和废物缸、培养皿、试管、三角烧瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天平、牛角勺、高压蒸汽灭菌锅、ph试纸、棉花、牛皮纸、麻绳、锥形瓶、洗瓶、载玻片、接种杯、酒秸灯、擦镜纸、显微镜2、染色液和试剂：牛肉膏、蛋白豚、NaCl.琼脂盐酸溶液、轼氧化钠溶液、无菌水、结晶紫、95%酒精、蕃红、碘液3、活

2、材料：枯草杆菌、培养24小时的大肠杆菌、金黄色衞萄球菌三、实验原理：1、用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带止电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它牛长丁中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采丿IJ碱性染料如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料焰前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。2、简单染色法是只用一种染料使细

3、菌着色以显示其形态，简单染色不能辨别细菌细胞的构造3、革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（GJ和革兰氏阴性菌（GJ两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为CT菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。菌的细胞樂小含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而口肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G*菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度髙，类脂质含量少，经脱色

4、剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。4、水的沸点可随压力的增加而提窩，当高压蒸汽灭菌锅中水煮沸时，锅是密闭的，蒸汽不能溢出，而使压力増加，水的沸点和温度也随Z增加。因此，高压蒸汽灭菌是利用高床蒸汽产生的高温，以及热蒸汽的穿透能力來达到灭菌的目的。一般在O.IMpa(151b/in2)的压力时,温度可达121°C只要维持15~20min,就可杀死一切微牛物的营养体和它们的各种砲子。四.实验步骤IO微生物的分离与纯化1•牛肉膏蛋白懂的制备(1)计算根据配方计算出实验中各种药甜所需要的量。(2)称量准确称取各种成分，一起放入烧杯中

5、。(3)溶解向烧杯内加入所需的水量，并加热融化。(4)调pH值川pH试纸测定其pH值，并川氢氧化钠溶液和盐酸溶液进行调节。(5)转移灭菌将配好的培养棊装入配有棉塞的三角瓶内。(6)包扎三角瓶的棉塞外用牛皮纸包扎，纸上表明培养基的名称、配制日期等。2、培养基的高压蒸汽灭菌(1)加水于灭菌器内到规定的水平而。(2)需灭菌的物品，培养基及包扎好的培养皿放入灭菌锅内的套筒中。摆放要疏松，太挤，否则阻碍蒸汽流通，影响灭菌效果。(3)将灭菌锅盖的排气管插人套筒侧壁的凹槽内，关闭灭菌锅盖旋紧螺栓，切勿漏气。(4)打开放气阀，加热，热蒸汽上升，以排除锅内冷空气，排气约5〜lOm

6、in,关闭放气阀。(5)关闭放气阀后，整个灭菌锅成为密闭状态，而蒸汽乂不断增多，这吋压力和温度都升，直至床力衣指针达到所需压力时，开始计时，通过调节热源，维持此压力到所需时间。(6)灭菌完毕，待压力自然降至0时，打开放气阀，注意不能打开过早，否则突然降压致使培养基冲腾，使棉塞、硅胶泡沫塞沾污，甚至冲出容器以外。(7)打开灭菌锅盖，取出已灭菌的器皿及培养棊。灭菌锅用完后，将锅内剩余的水倒掉,以免日久腐蚀。3、微生物的分离与纯化①分区域用记号笔在培养皿底划出三个区域，由小到大依次标记1、2、3,留下备用②倒平板：右手持盛培养基的三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞

7、轻轻地拨出，左手拿培养肌并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒人培养基，加盖后轻轻摇动使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌而上，待凝后即为平板，并用记号标明培养棊名称③划线在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，接种环烧完后，挑去培养皿内的菌种，然后在标记号的培养.IIIL中划线。现在一区中划，然后加热接种环，从一区中引出一条菌线，在二区中划线，依次法在三区中划线。划线时一区较紧凑，二区较松，三区最松。④将整理好的培养皿放入恒温条件卜培养，留待观察。II、微生物制片及染色技术及普通光学显微镜的使用1、简单染色:（1）涂片：取干净载玻片一•块，在载玻片上加一滴蒸懾

8、水，将接种环加热消毒后，