实验四+食品中细菌总数及大肠菌群的检测完

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1、实验四食品中细菌总数及大肠菌群的检测食品微生物学基础实验普通微生物学实验主讲：郑海涛一、目的要求1、掌握食品中微生物学基本指标的检测方法。了解食品质量与细菌和大肠菌群数量的重要关系2、通过实验，初步掌握食品中污染的活细菌计数方法，以判别食品的卫生质量1、菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。2、大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。由肠杆菌科中四个菌属内的一些细菌所组成，即艾希

2、氏菌属、枸橼酸杆菌属、产气克雷伯氏菌属和肠杆菌属。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。二、实验原理一、待测样品：奶粉还原液、豆腐等。二、培养基平板计数琼脂培养基、月桂基磺酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）、煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）,225m1无菌生理盐水、9m1无菌生理盐水、1mol/L氢氧化钠、1mol/L盐酸。三、无菌培养皿、革兰氏染色液、移液器、枪头、培养箱、水浴锅、电子天平、电炉、玻璃珠（直径为5mm）、试管架、酒精灯、灭菌镊子、75%酒精棉球、

3、玻璃蜡笔、不锈钢勺等。三、实验材料四、操作方法一、细菌总数：(1)以无菌操作将检样25克(或25ml)放于装有225ml灭菌生理盐水和玻璃珠的三角瓶中，充分振荡制作成1:10的均匀稀释液，样品PH值应在6.5-7.5之间，必要时用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸调节(固体食品需先用无菌均质器均质后再稀释)。(2)用移液器，吸取1:10稀释液1ml，注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内，振摇均匀，制成1:100的稀释液。(3)另取枪头，按上述操作进行10系列稀释成不同浓度的稀释液，如此每递增稀释一次，

4、即换用1支无菌枪头。(4)根据对标本污染情况的估计，选择2-3个稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即吸取该稀释度的稀释液1ml于灭菌培养平皿内，每个稀释度作两个平皿。(5)稀释液吸入平皿后，将融化并冷却至45℃的平板计数琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿使其混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml灭菌生理盐水的灭菌平皿作空白对照。(6)待琼脂凝固后，翻转平板，置36+1℃恒温箱内培养482小时后取出，计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克样品所含菌落总数。菌落总数的检验程序检样25g

5、(或25ml)样品＋225ml稀释液，均质10倍系列稀释选择2-3个样品匀液各取1ml,分别加入无菌培养皿内每皿加入15-20ml培养基摇匀36℃±1℃培养48±2h计算菌落数，报告梯度稀释操作方法二、大肠菌群检验：取样品及稀释方法与菌落总数检验方法相同，做成1:10的均匀稀释液为检样，取样量为1ml及0.1ml(相当于1克及0.1克奶粉样品)各3管。1．初发酵试验选择待测样品3个适宜稀释度接种于LST发酵管内，接种量在1ml以上者，用双料LST发酵管；每一稀释度接种3管，置361℃温箱内，培养24

6、2小时，如所有发酵管都不产气，继续培养242小时，观察倒管内是否产气，如未产气可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则进行复发酵试验。2．复发酵试验将所有产气的LST发酵管分别转接在BGLB肉汤管中，置361℃温箱内，培养48h2小时,然后取出，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管3．报告根据复发酵试验的阳性管数，查大肠菌群最可能数(MPN)检索表。得出每1m1(g)食品中存在的大肠菌群数的近似值。检样25g或25ml＋225ml稀释液，均质10倍系列稀释，选三个适宜稀释度接种LST肉汤管36℃±

7、1℃培养48±2h不产气产气接种BGLB肉汤36℃±1℃培养48±2h不产气产气大肠菌群阴性大肠菌群阳性查MPN表，报告LST发酵管现象1．影响杂菌总数准确性的因素有哪些？2．在食品卫生检验中为什么要选用大肠菌群作为食品被污染的指标之一?3．在细菌总数检测中做空白对照实验的目的是什么？五、思考题谢谢