转座子挽救法对转座子突变菌株中插入位点定位分析

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1、!"卷#期微生物学报&’()!".’)#"$$"年%月!"#$%&"’()&(*(+&"$,&-&"$*+,-"$$"!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!转座子挽救法对转座子突变菌株中插入位点的定位分析"1"阮红6-7,897:;<=>9,,?（1浙江大学生命科学学院杭州#1$$"@）（"A(>大学微生物与生物技术学系德国）摘要：为寻找谷氨酸棒杆菌转座子插入突变菌株中的转座子插入位点，采用了转座子挽救法对转座子及其插入位点附近的序列进行分离，并测定插入位点相邻/.0序列，获得了三个

2、转座子插入位点/.0序列，其中一个是柠檬酸合成酶基因，另两个为目前未知基因，暂命名为!"#$和!"#%。该方法简便易行，是分析转座子插入位点的理想方法。关键词：转座子挽救法，插入突变，谷氨酸棒杆菌中图分类号：B2##文献标识码：0文章编号：$$$15%"$2（"$$"）$#5$#"%5$C采用转座子插入突变方法，将转座子导入染色体/.0并利用转座子插入位点处基因发生插入突变，从而筛选功能发生变化的突变株，最后来研究突变株中被插入的基因的功［1DC］能。该方法已经成为当今定向研究基因的行之有效的方法。本研究在谷氨酸棒杆菌&!"’()*+,-)"./

3、012/-+0.,/0中成功引入了转座子E,CC#1的基础上，对实验室筛选到的乙酸代谢调控功能突变株F"C上的插入位点进行了定向分析和研究。!材料和方法!"!菌株和质粒菌株、质粒及其相关特性见表1。其中转座子插入突变菌株F"C是将含E,CC#1的质粒GHFI$$!$对&)12/-+0.,/01!@C"进行/.0转化而筛选获得，测得其表型变化与乙酸代谢调控直接相关。表!本研究菌株和质粒!".培养基E9J(-169KL-7<9(?L79<,?9,:G(9><:?+?-:<,L8

4、OG(9?><:P-(-Q9,LK8979KL-7J7’’=)(8$:，2+,=!，1’"$>?，")2$:［1$］&)12/-+0.,/0等。根据实验要求，在不同的培养0EHH1!@C"T<:-LMG-?L79<,’R0EHH1!@C"U<,’?8+L9,L’

5、R0EHH1!@C"=--G<,V<,(9J基中加入C$"VO>I氨苄青霉素和C$"VO*+&),’-)：>I卡那霉素。3),!2.和&)12/-+0.GP，’7P，’7<6P#""，E,@@A:0,=7<-L9()，122%［2］,/0分别置于#$Z和#@Z下培养。!"/012操作［11］&)12/-+0.,/01!@C"总/.0抽提参照;<=>9,,?等方法。质粒的酶切降解、脱磷酸［1$］化和连接反应、3),!2.电激转化等参照N9>J7’’=等方法；

6、&)12/-+0.,/01!@C"中引入含"本课题由德国政府/00/奖学金和国家教育部联合资助作者简介：阮红（12%34），女，讲师，博士，从事微生物基因调控和生物活性成分研究。收稿日期："$$15$351%，修回日期："$$151$5""E期阮红等：转座子挽救法对转座子突变菌株中插入位点的定位分析E2U［12］转座子!"!!"#的质粒#$%&’’(’的电激转化参照)*"+,-.,/0等方法；345引物制备和样品测序由德国67%89:;0,<=5%公司测序中心完成。!"#转座子挽救法转座子挽救法是一类能有效定位分析转座子插入位点的方法，通过对转座

7、子及插入位点附近的序列的克隆分离，并进一步测定插入位点相邻345序列，可获得转座子插入位点处的345序列，从而达到转座子插入位点的精确定位。本实验转座子突变菌$>%&’()*+,’*%2D含有源于->,.&+%62J2J的质粒#$%&’’(’中的!"!!"#转座子，它是在革兰氏阳性菌$>%&’/.()*+,’*中成功应用的含有KF抗性基因的一类［J］转座子。由于转座子基因两侧具有-,..L和01)L酶切位点（图1），可将转座子突变菌株$>%&’()*+,’*%2D进行染色体345分离并且将之分图!转座子$%!!"#的结构和相邻染色体别进行-,..

8、L和01)L酶切，回收各自的酶切片段&’(测序的引物设计.克隆至带有5F#抗性标记的#M$1N载体中，转?:@>1A0-B<0B-,;C