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《转座子Tn917插入位点侧翼序列的扩增4》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、第26卷第6期生物学杂志Vol126No162009年12月JOURNALOFBIOLOGYDec,2009doi∶10.3969/j1issn11008-9632.20091061030转座子Tn917插入位点侧翼序列的扩增孟兆禄,马汇泉,董瑾,谭亚男(山东理工大学生命科学学院,淄博255049)摘要:为了克隆到生防菌株的抗病基因,以一株对灰葡萄孢菌表现很高拮抗活性的蜡样芽孢杆菌B202菌株为材料,利用转座子标签技术得到拮抗性消失的突变体,进而利用TAIL2PCR技术扩增出Tn917插入位点两侧的未知序列,利用生物信息学分析扩增序列,为进一步研究该基
2、因片段与菌株拮抗性之间的关系奠定了基础。关键词:蜡样芽孢杆菌;转座子标签技术;TAIL2PCR中图分类号:Q785文献标识码:A文章编号:1008-9632(2009)06-0030-04生物防治作为一种环境友好型植物病害防治技化回收试剂盒等均为TaKaRa公司产品;PCR仪(MAR2术,在植物病害可持续性控制体系中占有越来越重要TERCYCLE5333);所有特异性引物及兼并引物均由上的地位。然而,生物防治技术的应用在生产上远未普海生工生物技术有限公司合成。及,除其它原因外,生物防治技术防治效率低、防效不1.2实验方法稳定是重要原因。随着现代分子生物
3、技术的不断发展1.2.1蜡样芽孢杆菌B202突变体基因组DNA提取与创新,从基因水平探索生物防治的机理成为生物防按照常规提取细菌基因组的方法提取突变体菌株[1-2]基因组治研究的热点。李桂霞等从番茄土壤中得到一株DNA。高效拮抗番茄灰霉病的菌株,并利用质粒介导法将β21.2.2TAIL2PCR引物的设计1.3葡聚糖酶基因导入该菌株,显著提高了该菌株的利用PrimerPremier5.0软件在Tn917序列两端各[3]设计3条特异性引物,根据文献设计4条兼并引拮抗活性。董瑾等利用转座子标签技术,将转座子[6-8]导入目标基因组DNA中,使得插入位点处基因
4、发生突物,特异性引物的Tm值需高于兼并引物的Tm值(一般需相差10℃左右)。变并导致其相关功能活性丧失,从而筛选出目的功能特异性引物:发生突变的菌株,以研究该突变株中被插入部分的基DJTP515′2CAACAGAGAGATGTCACCGTCAAG23′因功能,转座子标签技术已成为当今定向研究功能基DJTP525′2CAACCGTTACCTGTTTGTGCC23′因行之有效的方法。本研究在前人研究的基础上,以DJTP535′2AAGACCAATCACTCTCGGACAATAC23′Tn917在蜡样芽孢杆菌B202基因组中的随机插入而得DJTP315′2A
5、ATTCCCACTAAGCGCTCGG23′到的抑菌活性丧失的突变菌株为材料,利用TAIL2PCRDJTP325′2AAACGGCCTTGAAACATTGG23′方法[4-5],扩增到了Tn917插入位点两侧的未知基因DJTP335′2TCACGTCAAAATAGATCCCGAAG23′兼并引物:序列,为进一步研究生防菌株拮抗基因的表达和调控AD15′2NTCGA(G/C)T(A/T)T(G/C)G(A/T)GTT23′机理奠定了理论基础。AD25′2NGTCGA(G/C)(A/T)GANA(A/T)GAA23′1材料与方法AD35′2(A/T)GTG
6、NAG(A/T)ANCANAGA23′1.1供试材料AD45′2AG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(A/T)AGG23′1.1.1菌株蜡样芽孢杆菌B202突变体,系由本实1.2.3TAIL2PCR法扩增Tn917插入位点两侧的未知验室利用Tn917随机插入到野生型蜡样芽孢杆菌B202序列中得到的拮抗性消失的突变体菌株。TAIL2PCR反应体系(单位:μL)。第一次反应:1.1.2培养基LEL:含红霉素(Em)1mg/L、林可霉DNA模板0.2,DJTP51/310.15,AD32,2×TaqPCRMas2素(Lin)25mg/L的LB培养基。te
7、rMix10,加ddH2O至总体积20;第二次反应:DNA模1.1.3主要试剂及仪器LATaqDNA聚合酶、DNA纯板1.0,DJTP52/320.25,AD32.5,2×TaqPCRMasterMix收稿日期:2008-11-10;修回日期:2009-02-20作者简介:孟兆禄(1972-),男,硕士研究生,主要从事微生物分子生物学研究;通讯作者:马汇泉(1962-),男,教授,主要研究方向为生物化学与分子生物学,E2mail:mhqswp@sdut.edu.cn。基金项目:山东省教育厅研究基金资助项目(J04C08)30第26卷第6期生物学杂志Vo
8、l126No162009年12月JOURNALOFBIOLOGYDec,200912.5,加d
