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1、230国外医学临床生物化学与检验学分册2000年第21卷第5期DNA测序技术新进展上海第二医科大学上海市医学检验重点实验室(200023)王强综述罗伟审校摘要分子诊断技术在遗传性疾病、肿瘤和感染性疾病的诊断领域内占有重要的位置,DNA测序(DNAsequencing)为其中最精确的一种方法,主要用于鉴定基因,检测突变,分析噬菌体文库等方面。本文介绍了DNA测序技术近年的新进展。关键词DNA测序;分子诊断技术1977年Sanger创立了链终止反应测序法,他用915h;Utah的Swerdlow和Gesteland改在高电场下
2、进行放射性同位素标记的双脱氧核苷酸终止DNA链的延电泳后,大大地提高了分析速度。毛细管电泳仪的两伸,产生序列梯度,再由高分辨力的聚丙烯酰胺凝胶个电极室由一根毛细管相连接,有利于快速散热,适电泳分离,放射自显影读取结果。1986年Hood实验宜在高电场下运行;毛细管内径通常为20～200μm,室的Smith用四色荧光标记的测序引物,单一泳道电长度为10～100cm,最大承载电流100μA,适宜电场强[1,4]泳,激光诱导荧光法(LIF)进行测序,使测序方法由手度200～400V/cm。毛细管凝胶电泳(capillarygel
3、工进入自动化操作;Prober则是用荧光标记双脱氧核elecrophoresis,CGE)把传统的凝胶板电泳方法引入CE苷酸链终止法进行测序的,这两种方法分别被Perkin2技术中,用聚丙烯酰胺或琼脂糖灌注毛细管,对短Elmer和Dupont公司商品化为测序仪。荧光标记法DNA片段具有很高的分辨率,精确度达015bp,分离是医学和生物学检测领域中取得的重大突破,目前的180～200bp序列效果最好。CGE的缺点是其基质易DNA测序方法多建立于其基础之上,荧光标记自动于被高电流所破坏,故运行时间受到一定的限制,寿化分析仪已成
4、为DNA测序技术进步最明显的标命约为10～15h。羁滞溶液毛细管电泳(entangled2so2[1,2]志。近年来又有人研制了毛细管列阵电泳和lutioncapillaryelectrophoresis,ESCE)是CGE的改进技DNA芯片,极大地提高了测序速度和效率;与此同术,用多聚体羁滞网络(entangledpolymernetworks)替时,质谱技术与显微制造技术(microfabrication)的发展代聚丙烯酰胺凝胶和电泳缓冲液,该物质包括疏水多和应用为DNA分子的序列分析提供了又一种强有力聚体、非交联线性
5、聚丙烯酰胺、聚葡聚糖、聚环氧乙烷的工具。下面就近年来DNA测序技术的新进展作一和纤维素衍生物(甲基纤维素、羟丙甲基纤维素)等非简要评述。交联溶液,尽管粘稠,但可以被泵入或泵出电泳室,即所谓的可替换凝胶(replaceablegel)。ESCE可用于分1超薄凝胶板电泳(ultrathinslabgelelectrophoresis)离小为单核苷酸,大至百万碱基的DNA片段,电泳介早期使用的电泳凝胶板厚达400μm,易于形成高质可以在每次运行后由加压作用自动替换,使毛细管[5]电流而产热,影响电泳条带结果的分析,用薄凝胶板寿命
6、得到延长,可达100h以上。用高电压超薄凝电泳后增加了散热速度,可使用电压达到150V/cm,胶测序600～1200碱基序列需运行2～12h,而使用有利于快速分离DNA片段。Hietpas用单毛细管导入CE时,测序1000碱基序列DNA片段只需80min,且样品的方法把薄凝胶板电泳和毛细管列阵电泳的优测序长度也能够得到大幅度提高。毛细管列阵电泳点结合起来,使样品导入更方便,能同时运行多个样(capillaryarrayelectrophoresis,CAE)可同时分析96个品,而且不需要多个毛细管进样孔,省去了毛细管列以上
7、的样品,速度较常规CE又提高了10倍,分离75阵的繁琐。单毛细管导入法的理论基础是不同大小～1632bp的DNA片段只需150s。最近,整合热循环的DNA片段具有相似的质荷比,因此所有的限制性PCR等反应和CE于芯片上所设计的微分析设备能消化片段可作为单一的组分通过毛细管进入凝胶板。够完成PCR扩增15min,CE2min,完整的试验分析不[6]此法使凝胶板厚度降至57μm,提高了分析效率,DNA到20min。CE分离核酸的主要影响因素是凝胶质片段可分析长度范围扩至50～1400bp,其优点是可量、电压、毛细管长度、温度、
8、缓冲液以及碱基组成等,以重复导入小体积样品入凝胶中,样品泳道缩至1mm对于单链DNA分子,3%、5%和8%的凝胶可分离的宽,增加了可分析样品的数量,缺点是DNA片段分离DNA片段的长度分别为50～1000mer,20～500mer和[3]间距缩小。10～300mer;对于双链DNA分子,其可分离长度依次
