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1、食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES*双水相法萃取生姜蛋白酶体系的建立11112谢芳,唐晓珍,马明,杜新永,卢会忠1(山东农业大学食品科学与工程学院,山东泰安,271018)2(山东省莱芜市莱城区农业局,山东莱芜,271100)摘要以生姜为原料,研究了采用双水相萃取技术分离提取生姜中生姜蛋白酶的提取条件,利用单因素试验与正交试验进行优化,优化得到的萃取方案为:PEG分子质量为4000u,PEG浓度为30%,选择盐种类为(NH4)2SO4,浓度为10%,体系pH为80。此双水相体系的生姜蛋白酶上相酶活力回收和纯化倍
2、数都最高,分别可达39377%和185。关键词双水相萃取,生姜蛋白酶,酶活力,分配系数生姜蛋白酶(EC342267)是从生姜中提取的[1][2]1材料和方法有蛋白水解活性的酶,可用于肉类嫩化、酒类澄[3]清等。其提取分离技术有超滤法、盐析法、有机溶11试验材料剂法、絮凝法、亲和层析法等。然而,生姜蛋白酶属大生姜:由山东省莱芜市莱城区农业局提供。分子物质,超滤过程中易在膜表面聚积而产生浓差极12仪器及试剂化现象,且生姜蛋白酶在有机溶剂中易变性以及存在UV2450型紫外分光光度计,日本岛津公司;80有机溶剂残留等问题;盐析法提取
3、的生姜蛋白酶活性2B型离心机,上海医疗器械厂;JH28型美菱榨汁、较低,与应用要求相差甚远;絮凝法提取专一性不强,搅拌机,美菱集团;JJ1型精密增力电动搅拌器,常州制得的生姜蛋白酶纯度不高;亲和层析法提取的酶纯国华电器有限公司。度虽然较高,但是操作复杂,不易工业化生产。相对TCA(纯度990%)、EDTA(纯度995%),天津来说,双水相萃取法能有效分离提取高纯度生姜蛋白凯通化学试剂有限公司;酪蛋白(含氮145%~酶。原因是双水相萃取具有两相界面而张力低,有助155%)、考马斯亮蓝G250(分析纯)、L半胱氨酸于保持生物活性和强化相际间的
4、质量传递,易于连续(含量98%~102%),上海化学试剂供应站;各种聚化操作,具有目标产物收率高,不存在有机溶剂残留,乙二醇(PEG800、PEG1000、PEG2000、PEG4000、分离过程经济等特点。PEG6000、PEG8000),天津巴斯夫化工有限公司;生双水相萃取(ATPS)技术是利用一种高分子聚合姜蛋白酶,实验室提供;其他为实验室常规试剂。物和无机盐的混合溶液或两种水溶性不同的聚合物,13试验方法在一定浓度下将体系分成互不相溶的两相,由于表面131生姜蛋白酶(粗酶)的提取性质、电荷间及各种作用力(如憎水键、氢键和离子取外形完好,
5、无机械损伤和腐烂的生姜,切成小键)等因素的影响,使得目标蛋白酶和其他蛋白质在块,与磷酸缓冲液(003mol/L,pH75,内含1mmol/L[4-5]两相间的分配系数不同,从而达到分离目的。通EDTA和5mmol/LL半胱氨酸)按料液比(gmL)12过调整双水相系统中一系列参数就可选择性地萃取[6]放入榨汁机中打浆,所得浆液低速搅拌20min,并加目标蛋白酶。本实验对成相物质组成、浓度和萃入20%(NH4)2SO4,4层纱布过滤后,滤液4静置取条件进行了初步探索,建立了操作条件温和、能耗2h,离心(4800r/min,5min)去除沉淀,上清
6、液用15低、易放大、可连续操作、无有机溶剂残留、简单可行倍的无水乙醇进行沉淀,再次离心,去除上清液后收的分离提取生姜蛋白酶的方法。集沉淀(即粗酶)。粗酶放置于冰箱中冷冻备用,使第一作者:硕士研究生(唐晓珍教授为通讯作者)。用前将粗酶用上述磷酸缓冲液110溶解并低温过*山东省科技攻关项目(2007GG30009002);山东省自然科学基金滤。项目(Q2004B01)收稿日期:2010-08-25,改回日期:2010-10-24132双水相萃取将不同分子量的聚乙二醇和成相盐按质量比配1842011Vol37No1(Total277)分离与提
7、取制一系列不同浓度及pH的双水相体系。加入一定由图1看出,通过增加聚合物的分子质量,上下量的聚乙二醇和盐后用去离子水调系统总质量至20相蛋白质分配系数(KP)呈逐渐下降趋势,说明蛋白g。充分溶解后倒入60mL的分液漏斗中进行分相,质随着聚合物分子质量的降低逐渐分配到富含该聚[8,10]分相完成后再加3mL的生姜蛋白酶粗酶液。将分液合物的相中,这与高分子聚合物的体积排阻效应漏斗封口,反复倒置2~3min,每分钟10~15次,将有关。聚合物分子质量过高,体积排阻效应增大导致体系各组分充分混合均匀后,室温下静置分相2h,使生姜蛋白酶在相间的传递和在相中的扩散阻
8、力大大体系上下相分离完全。测定上下相体积、总蛋白质浓增加,不利于生姜蛋白酶进入P
