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《论著SD大鼠βB2-晶体蛋白的克隆,表达与纯化X》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、现代临床医学生物工程学杂志 2005年第11卷第1期1·论 著·XSD大鼠βB2-晶体蛋白的克隆、表达与纯化刘梦蕾,李闻捷,蔡 刚,张 燕,张 军(第二军医大学长海医院中心实验室 上海 200433)【提 要】 目的 得到大量纯的βB2-晶体蛋白,为研究其生物学特性及潜在的生理功能打下基础.方法 从SD大鼠晶状体中抽提总RNA,用RT-PCR法克隆βB2-晶体蛋白的cDNA,装入原核表达载体pGEX-4T-1后用萘啶酮酸(IPTG)诱导表达;用GST纯化系统纯化并用蛋白水解酶对融合蛋白进行酶切.结果 βB2-pGEX重组质粒经测序及限制性内切酶分析等鉴定,与预期结果一致;IPTG诱导后,
2、蛋白质在大肠杆菌BL21中得到高效表达.纯化酶切后,经Westenblot方法验证,得到了高纯度的βB2-晶体蛋白.结论 成功构建了βB2-pGEX原核表达载体,高效表达了βB2-GST融合蛋白,经纯化和酶切得到了高纯度的βB2-晶体蛋白,为进一步研究其生物学特性及潜在的生理功能打下基础.【关键词】 βB2-晶体蛋白;克隆;表达;纯化;大肠杆菌[中图分类号]Q51[文献标识码]A[文章编号]1008-634X(2005)01-0001-03Clone,ExpressionandPurificationofSDratβB2-CrystallinLIUMeng2lei,LIWen2jie,C
3、AIGang,etal.(Centrallaboratory,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China)【Abstract】ObjectiveToobtainlotsofpureβB2-crystallinforthebaseofstudyingit’sbiologiccharacteristicandpotentialphysicalfunctions.MethodsThecDNAofRatlenswasobtainedbyPR-PCRusingthetotalRNAgotfromratl
4、ensasmouldingboard,thenclonedintopGEX-4T-1vectorandinducedbyIPTG.Purificationandcuttingbyproteasewasdonerefertothespeci2ficationoftheGSTpurificationsystem.ResultsTheconstructedrecombinantβB2-pGEXplasmidhadbeenidentifiedbyrestrictionendonucleasecuttingandsequencing.Theexpressionoftherecombinantpla
5、smidwasidentifiedbyWesternblot.ConclusionsTherecombinantβB2-pGEXplasmidhadbeenconstructedandexpressedcorrectly,andthepurificationwassuccessful.TheobtainngofpureβB2-crystallinlaysthefurtherstudyofit’sbiologiccharacteristicandpotentialphysicalfunctions.【KeyWords】βB2-crystallin;Clone;Expression;Puri
6、fication;Escherichiacoli 晶体蛋白的三种主要组份:α、β及γ在老化进程纯化、酶切,去掉了GST,得到了大量高纯度的βB2-中发挥不同的作用.目前,对于α-晶体蛋白的特性晶体蛋白.及生物作用机理已有较深入了解,并确认了α-晶体1 材料与方法蛋白最重要的生物功能———伴侣蛋白(chaperone)作[1,2]1.1 材料用;但对晶体的另一个重要结构蛋白β族的生物1.1.1 工具酶及试剂盒 柱离心式DNA抽提试剂盒学特性及潜在的生理功能,所知较少.β族晶体蛋白购自上海生物工程技术服务有限公司;Trizol购自含有多种晶体蛋白,包括βB1、βB2、βB3、βA1、βA2
7、、βA3、Gibco公司;RT-PCR试剂盒、核酸内切酶BamHI、SalβA4晶体蛋白.其中βB2是β族中含量最高的一种晶I及DL2000DNAmarker购自TaKaRa公司;高保真Taq体蛋白,在大鼠的老化过程中,该水溶性蛋白的相对DNA聚合酶购自上海生物工程有限公司;胶回收试剂含量随老化呈“反常”年龄依赖性升高,与通常的概念(老化使水溶性蛋白成份下降)相反[3].为了探讨β盒购自维特杰公司;引物由上海捷倍思基因技术有限族的主
