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1、仲恺农业技术学院学报,17(1):40~44,2004JournalofZhongkaiAgrotechnicalCollege文章编号:1006-0774(2004)01-0040-05邻苯二甲醛衍生荧光光度法测定莲子中游离氨基酸总量马应丹,刘文根(仲恺农业技术学院食品科学系,广东广州510225)摘要:以邻苯二甲醛和-巯基乙醇为衍生化试剂,用荧光分光光度计测定莲子中游离氨基酸总量.在荧光光度计激发波长为360nm,发射波长为420nm时,测定其回收率为9955%~9995%,变异系数为160%.莲子中游离氨基酸总量为095%~
2、113%,变异系数为015%~051%.关键词:荧光光度法;邻苯二甲醛;游离氨基酸;莲子中图分类号:O657;O629文献标识码:B氨基酸在-巯基乙醇等试剂存在下与邻苯二甲醛迅速反应生成的1-硫代-2-烷基异吲哚衍生物能产生荧光,可用作高灵敏度荧光检测.这种衍生方法步骤简单,反应速度[1~3]快,剩余试剂不干扰测定,故多应用于氨基酸的高效液相色谱法测定.氨基酸总量的测[4]定目前大多数采用甲醛滴定法、茚三酮分光光度法等.作者采用类似的衍生方法,建立一种测定氨基酸总量的荧光光度法.应用本法测定多个莲子样品的游离氨基酸总量
3、,取得了满意的结果.1材料和方法11仪器和试剂111仪器930型荧光光度计,上海第三分析仪器厂生产;800型离心沉淀器,上海手术器械厂生产;SB3200型超声波仪,上海必能信超声有限公司生产;PHS2C型酸度计.112试剂和材料邻苯二甲醛,Flucka公司生产;-巯基乙醇,Synthese公司生产;L--丙氨酸,生化试剂,上海第二军医大学试剂研究室提供;莲子,市售.12试剂配制12101%邻苯二甲醛衍生化试剂称取50mg邻苯二甲醛,加入1ml无水乙醇使其完全溶解,再加入19mlpH95的硼酸缓冲溶
4、液和200l-巯基乙醇,混匀,用硼酸缓冲液稀释至50ml.4冰箱保存,保存期两周,每隔1d补充10l-巯基乙醇.收稿日期:2003-06-23作者简介:马应丹(1945-),男,广东海丰人,副教授.第1期马应丹,等:邻苯二甲醛衍生荧光光度法测定莲子中游离氨基酸总量41122pH95硼酸缓冲溶液准确称取硼酸24740g溶于水并稀释至100ml,再用2mol/LNaOH溶液调pH至95.123pH804磷酸缓冲溶液准确称取磷酸二氢钾22675g于烧杯中,用少量去离子水溶解后,定量转入250ml容量瓶中,用水
5、稀释至刻度,摇匀;同法称取磷酸氢二钠59690g用水溶解并定容至250ml.取上述配好的磷酸二氢钾100ml与磷酸氢二钠1900ml混合均匀即得pH804的磷酸缓冲溶液.124丙氨酸标准溶液准确称取丙氨酸1000mg,用去离子水溶解定容至50ml,准确吸取00、05、10、15、20、25、30、35、40ml分别置于100ml容量瓶中,用去离子水定容至刻度,相当于每毫升含有00、100、200、300、400、500、600、700、800g丙氨酸.此系列标准溶液应在临用时配制.13
6、实验方法131样品预处理准确称取莲子样品1g,用少量去离子水充分研磨搅拌均匀,完全转移至100ml的容量瓶中,加80ml去离子水,超声波处理20min,用去离子水定容后过滤,滤液为样品溶液,待用.132衍生化反应精确吸取上述已处理好的样品溶液10ml,补加去离子水至20ml.加入01%邻苯二甲醛衍生化试剂20ml,再加入pH804磷酸缓冲溶液20ml,在暗处反应5min后得衍生物溶液.133相对荧光强度的测定调整荧光光度计,在激发波长为360nm和发射波长为420nm时,以标准空白液调零,对浓度为80
7、0g/ml的丙氨酸标准溶液的荧光强度调节为800,测定样品溶液的相对荧光强度.2结果与讨论21检测波长的确定取800g/ml的丙氨酸溶液2ml按132制得衍生物溶液,于荧光光度计测定其激发光谱和发射光谱(图1).由光谱图中两荧光强度曲线确定其激发波长和发射波长分别为360nm和420nm.22衍生化反应时间的选择按21方法制备衍生物溶液5份,分别在0、15、30、50、60min时测得其相对荧光强度分别为243、369、604、759、753.根据试验结果选取50min为最佳衍生化反应时间.22衍
8、生物的稳定性按21方法制备丙氨酸标准的衍生物溶液,再按13方法制备两份莲子样品的衍生物溶液,分别在60min内每隔5min测定其相对荧光强度(图2).由图2可以看出,氨基酸的
