Cre_ lox P系统介导的基因重组及其在酵母中的应用

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1、中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（６ｓ）：４６～４９Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系统介导的基因重组及其在酵母中的应用１，２１１和东芹肖冬光吕烨（１天津科技大学天津市工业微生物重点实验室天津３００４５７２２邯郸职业技术学院邯郸０５６００１）摘要Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系统是源于Ｐ１噬菌体的一个ＤＮＡ重组体系，具有位点特异、时期特异、组织特异和高效重组的特点，它为转基因生物工程研究提供有力工具。概述了Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系统的组成、结构、作用方式、机制、特点及其在酵母中的应用。关键词Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系统Ｃｒｅ重组酶酵母基因敲除基因重组中图分类号Ｑ７８９基因重组

2、是现代生命科学的两大重要技术之一，分为同源重组、位点特异性重组、非同源重组以及转座重组。Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系统是源于Ｐ１噬菌体的一个ＤＮＡ重组体系，是位点特异性重组中应用最为广泛的一种，由重组酶Ｃｒｅ及其特异性靶位点ｌｏｘＰ两部分组成。该系统能导致在特定的ＤＮＡ序列（ｌｏｘＰ位点）处发生定点重组，将外源基因定点整合到染色体上或将特定ＤＮＡ片段删除。１Ｃｒｅ重组酶及其结构图１一个Ｃｒｅ重组酶分子与ＤＮＡ结合的模式图Ｃｒｅ重组酶于１９８１年由Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ发现于Ｐ１噬菌［１］（Ｇｕｏ，１９９７）体，是一种无须辅助因子进行位点特异性重组的生Ｆｉｇ．１ＯｎｅＣｒｅｒｅｃｏｍｂｉｎ

3、ａｓｅｂｏｕｎｄｔｏｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉ物酶，属于λＩｉｎｔ酶超基因家族（ｉｎｔｅｒｇｒａｓｅｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ），ＤＮＡｓｕｂｓｔｒａｔｅ是一种位点特异性重组酶，它能识别３４ｂｐ部分回文的ｌｏｘＰ序列。１９９４年Ｇｕ等首次将Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系统应用到Ｎ?末端由第２０至第１２０个氨基酸组成，包含有５［２］基因打靶中，建立组织特异性基因打靶小鼠。个α螺旋：螺旋Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ。螺旋Ａ、Ｅ在重组过程中在研究Ｃｒｅ重组酶的结构与功能的过程中，Ｇｕｏ与Ｃｒｅ重组酶四聚体的形成有关；螺旋Ｂ、Ｄ与ＤＮＡ的［３］等发现该酶由两个明显的结构域组成：较小的Ｎ?末大沟相连，螺旋Ｂ与反向平

4、行束的疏水面紧密接触；螺端结构域和较大的Ｃ?末端结构域，结构域间由一个短旋Ｃ未与ＤＮＡ分子相连。Ｃ?末端区块是Ｃｒｅ重组酶的链相连。两个结构域在结合位点周围形成“夹子”结主要活性中心，由第１３２至第３４１个氨基酸组成，共包构，以和ＤＮＡ分子的大小沟部位充分接触（图１）。在含９个α螺旋：螺旋Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｊ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，螺旋间有重组过程中，Ｎ?端和序列的识别有关系，Ｃ?端和ＤＮＡ的２个小的β?折叠片结构。Ｃ?端结构域和ＤＮＡ的接触面结合及ＤＮＡ链的切割有关系。复杂，大部分的螺旋和连接环均与ＤＮＡ分子的大小沟收稿日期：２００８０３２６修回日期：２００８０４０５及主

5、链部位相互作用。参与重组反应的Ａｒｇ１７３位于螺高等学校博士学科点专项科研基金资助项目（２００５００５７００１）旋Ｈ上、Ｈｉｓ２８９、Ａｒｇ２９２位于螺旋Ｋ上；螺旋Ｊ与ＤＮＡ通讯作者，电子信箱：ｘｉａｏ９９＠ｔｕｓｔ．ｅｄｕ．ｃｎ２００８，２８（６ｓ）和东芹等：Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系统介导的基因重组及其在酵母中的应用４７［５］的大沟相连，这也是Ｃ?端唯一与ＤＮＡ大沟直接接触的适用；ｌｏｘＰ位点中的８ｂｐ间隔区的不对称性使ｌｏｘＰ部位；螺旋Ｌ与螺旋Ｍ形成一个疏水区，在重组过程中位点具有方向性，从而决定了重组的方向性。在Ｃｒｅ酶有活性的氨基酸大多数均位于该部位，其中有切割活的

6、介导下，Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ定位重组系统在细胞内和离体系统［６］性酪氨酸（Ｔｙｒ３２４）位于螺旋Ｍ上，该部位是Ｃｒｅ重组中共有以下３种工作方式：当２个ｌｏｘＰ位点方向相酶的主要活性中心；螺旋Ｎ远离其他螺旋，有助于Ｃｒｅ同时，重组反应的结果是ｌｏｘＰ位点之间的ＤＮＡ片段被亚基间相互接触。在重组反应中，与２个ｌｏｘＰ位点结删除；当２个ｌｏｘＰ位点的方向相反时，Ｃｒｅ介导的重组合的不同Ｃｒｅ亚基间Ｎ?端结构相似，而分子间Ｃ?末端反应使ｌｏｘＰ位点之间的ＤＮＡ片段倒位；如果２个ｌｏｘＰ构象有很明显的差异，这说明不同Ｃｒｅ亚基在重组过程位点不在同一分子上，比如一个质粒上带有一个ｌｏｘＰ中

7、所起的作用不同。在与２个ｌｏｘＰ位点结合的４个位点．而在某个染色体上还有一个ｌｏｘＰ位点，那么在Ｃｒｅ酶中，只有２个有重组活性。Ｃｒｅ重组酶的介导下，质粒ＤＮＡ便可以整合到染色体中ｌｏｘＰ所在的位置上。２Ｃｒｅ重组酶的识别位点———ｌｏｘＰ位点４Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ定位重组系统的作用机制ｌｏｘＰ位点是Ｃｒｅ酶的特异性识别位点。ｌｏｘＰ是一段长度为３４ｂｐ的ＤＮＡ序列，由两个ｌ３ｂｐ的反向重复在重组反应过程中，４个Ｃｒｅ重组酶分子同２个序列和一个８ｂｐ的不对称间隔区组成（图２）。缺失分ｌｏｘＰ位点结合形成一个复合体，其中